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小RNA干扰靶向抑制Par-4基因表达对人骨髓间充质干细胞凋亡的影响
目的 探讨小RNA干扰靶向抑制Par-4基因表达对人骨髓间充质干细胞凋亡的影响.方法 原代培养人骨髓间充质干细胞,谷氨酸诱导凋亡.设计和合成针对Par-4基因mRNA的siRNA(Par-4-siRNA),构建真核细胞表达载体,用脂质体介导转染入骨髓间充质干细胞,利用G418筛选稳定表达细胞株.实时荧光定量PCR(real-time PCR)法检测Par-4 mRNA的表达量.流式细胞术测定细胞凋亡百分率.Western blot测定磷酸化(Thr308)的蛋白激酶Akt1蛋白表达量.比色法测定Caspase-3酶活性.结果筛选出的Par-4-SiRNA-1、2显著抑制人骨髓间充质干细胞中Par-4基因的mRNA表达,mRNA水平分别降低88%、67%.在谷氨酸诱导后24 h,人骨髓间充质干细胞发生凋亡,百分率为60.30%±6.82%.Par-4-SiRNA-1、2都显著抑制谷氨酸的诱导作用,凋亡百分率降为38.80%±3.97%(P＜0.01)和45.49%±4.32%(P＜0.01).谷氨酸诱导后24 h人骨髓问充质干细胞中磷酸化Akt1蛋白表达下调(89.07±6.42和28.30±5.65,P＜0.01),而Par-4-SiRNA-1、2对之下调都有显著抑制作用(63.56±6.75和45.59±4.88,均有P＜0.01).谷氨酸诱导后24 h人骨髓间充质干细胞中Caspase-3酶活性上调(0.1428±0.0495和0.8616±0.1051,P＜0.01),而Par-4-SiRNA-1、2对之上调都有显著抑制作用(0.6581±0.0555和0.7041±0.0401,均有P＜0.01).结论 小RNA干扰可靶向抑制Par-4基因的表达,拮抗谷氨酸诱导的人骨髓间充质干细胞的凋亡.
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IGFBPrP1siRNA诱导的大鼠肝星状细胞凋亡及其机制
目的 研究IGFBPrP1 siRNA对大鼠肝星状细胞凋亡的影响,并探讨其可能的机制.方法 体外培养大鼠肝星状细胞株(HSC - T6),分别设立:正常对照组,阴性对照组,IGFBPrP1 siRNA转染组.IGFBPrPI siRNA转染大鼠肝星状细胞,转染不同时间后,用CCK -8试剂盒检测肝星状细胞增殖的变化,ArnexinV/PI双标法流式细胞术检测肝星状细胞凋亡的变化,免疫细胞化学染色法检测P53及Bcl-2蛋白表达的变化.结果 I 1)IGFBPrP1 siRNA转染大鼠肝星状细胞不同时间(24、48、72 h)后,转染组细胞增殖受到抑制且凋亡率明显增高,与正常对照组及阴性对照组相比,差异均有统计学意义(P＜0.01)；(2) IGFBPrP1 siRNA转染大鼠肝星状细胞48 h后,与正常对照组及阴性对照组相比,转染组P53蛋白的表达量显著增高(P＜0.01)；Bcl -2蛋白的表达明显降低(P＜0.01).结论 IGFBPrP1 siRNA能显著抑制大鼠肝星状细胞增殖且能促进其凋亡；上调P53的表达,下调Bcl -2的表达可能是IGFBPrP1 siRNA诱导大鼠肝星状细胞凋亡的途径之一；推测抑制IGFBPrP1的表达有可能成为治疗肝纤维化的新靶点.
关键词： 胰岛素生长因子结合蛋白相关蛋白 肝星状细胞 肝硬化 RNA小分子干扰 细胞凋亡 -
siRNA沉默APE1/Ref-1基因增强人胰腺癌细胞株对吉西他滨的敏感性
人脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子-1(APE1/Ref-1)基因与肿瘤的化放疗抵抗和预后密切相关,是肿瘤基因治疗的理想靶点.目的:以RNA干扰技术靶向沉默人胰腺癌细胞株APE1/Ref-1基因,观察该方法对细胞增殖和凋亡的影响及其能否增强胰腺癌细胞对吉两他滨的敏感性.方法:将靶向APE1/Ref-1基因的小干扰RNA(siRNA)转染人胰腺癌细胞株SW1990,半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹法检测APE1/Ref-1基因和蛋白表达,CCK-8检测细胞增殖情况,流式细胞仪和Hoechst 33258染色检测细胞凋亡情况.结果:转染APE1 siRNA后,SW1990细胞APE1/Ref-1 mRNA和蛋白表达显著减低,蛋白表达抑制率为55.4%±3/6%;24 h、48 h和72 h时细胞增殖抑制率分别为41.7%±2.8%、24.8%±3.7%和21.3%±9.8%;吉西他滨组、si-APE1组和联合组均可见明显细胞凋亡,联合组早期凋亡率显著高于两者单用和空白对照组(19.8%±3.5%对7.7%±1.1%、8.4%±1.0%和2.7%±1.4%,P<0.05).凋亡核形态学变化为明显.结论:沉默APE1/Ref-1基因能抑制SW1990细胞增殖.促进细胞凋亡,显著提高细胞对吉西他滨的敏感性.RNAi沉默APE1/Ref-1基因联合吉西他滨化疗可能成为胰腺癌治疗的新的选择.
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shRNA干扰对肺癌细胞内Skp2和p27水平及其生长的影响
目的:探讨干扰肺腺癌SPC-A-1细胞中Skp2 (S-phase kinase associated protein, Skp 2)基因的发夹结构RNA (small hairpin RNA, shRNA)对肺癌细胞Skp2和p27基因表达的影响及对细胞生长的影响.方法:设计、合成特异性的shRNA序列并与pGenesil-1质粒载体连接转染SPC-A-1细胞,经过稳定筛选后的肺癌细胞,通过RT-PCR和Western印迹法分别检测细胞内Skp2、p27mRNA和蛋白的表达情况,MTT法检测细胞生长情况并绘制生长曲线.结果:在转染干扰RNA后SPC-A-1细胞内的Skp2mRNA及蛋白表达下降明显,而p27蛋白水平却明显上升,这与抑制了Skp2表达导致p27降解减少有关.生长曲线表明细胞生长受到了抑制.结论:成功构建了针对Skp2基因的shRNA真核表达载体,能有效抑制肺癌细胞生长,并使得skp2基因表达下降,p27基因的表达增多,为肺癌细胞的基因治疗提供了实验依据.
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HSP70 siRNA对宫颈癌HeLa细胞HSP70表达及细胞增殖与凋亡的影响
目的 通过体外实验观察HSP70的小分子干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)对宫颈癌HeLa细胞株增殖及凋亡的影响,探讨HSP70在HeLa细胞增殖和凋亡中的功能.方法 针对HSP70基因设计siRNA序列,克隆到空载体pTZU6+1中,转化DH5α菌株,提取质粒,进行酶切鉴定和测序分析.在脂质体2000的介导下转染HeLa细胞,同时转染空载体为阴性对照及不加任何试剂的空白对照.转染48 h后,应用半定量RT-PCR,Western blot检测HeLa细胞HSP70 mRNA及蛋白的表达情况;MTT法检测HeLa细胞的生长抑制率;AO/EB染色法观察HeLa细胞形态学变化;流式细胞术检测HeLa细胞的凋亡率和细胞周期分布情况.结果 与对照组相比,转染pHSP70-siRNA组HSP70的mRNA及蛋白表达均明显下降(P<0.01),表明Phsp70-siRNA质粒转染能有效降低HSP70的表达;细胞生长抑制率明显增高(P<0.05),且在48 h时细胞抑制率达到大;在荧光显微镜下观察到HeLa细胞出现凋亡形态;流式细胞术结果显示pHSP70-siRNA组细胞凋亡率显著高于对照组,且G_0/G_1期细胞减少,G_2/M和S期细胞增多.结论 HSP70 siRNA可以有效抑制宫颈癌HeLa细胞增殖,促进HeLa细胞凋亡;HSP70可能成为宫颈癌基因治疗的一个新靶点.
关键词： HSP70热休克蛋白质类 RNA小分子干扰 Hela细胞 细胞凋亡 -
小分子RNA干扰Notch1基因对肾癌Caki-1细胞增殖的影响
目的:探讨Notch1在肾透明细胞癌株中的表达,采用短片段RNA(small interfering RNA,siRNA)干扰技术沉默肾透明细胞癌中Notch1的表达,并观察其对Caki-1增殖的影响.方法:体外培养人正常肾小管上皮细胞HK-2及人肾癌细胞786-O和Caki-1.实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测Notch1 mRNA的表达,蛋白印迹法检测Notch1蛋白的含量.特异性Notch1 siRNA干扰肾癌Caki-1细胞,用Lipofectamine 2000转染48h后,实时荧光定量PCR和蛋白印迹法分别检测其中Notch1 mRNA、蛋白的表达变化,CCK-8与克隆形成实验检测其增殖情况.结果:Notch1在肾癌细胞株中的表达要明显高于正常肾小管上皮细胞,差异具有统计学意义(P<0.05).siRNA-Notch1干扰以后可以明显降低Caki-1细胞中Notch1 mRNA和蛋白的表达,差异具有统计学意义(P<0.05),同时检测Caki-1细胞增殖能力也随之下降(P<0.05).结论:Notch1在肾癌透明细胞癌中高表达,下调Notch1信号通路可以抑制肾细胞癌Caki-1的增殖,调节肾癌的生长.
