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增强PIAS3表达对CHG-5细胞生物学效应的影响
目的 探讨增强人胶质瘤CHG-5细胞内的活化STAT3抑制蛋白(protein inhibitor of activated STAT3,PIAS3)表达对CHG-5细胞增殖及凋亡等生物学效应的影响.方法 构建PIAS3真核表达载体pEGFP-N1-PIAS3,使用脂质体法瞬时转染人CHG-5胶质瘤细胞,同时设置空白对照组和阴性对照组,转染48 h后用RT-PCR、蛋白质印迹法和免疫组化法分别在核酸和蛋白水平检测目的蛋白表达,采用流式细胞技术检测转染后的胶质瘤细胞凋亡和细胞增殖变化.结果 转染后的CHG-5细胞可见PIAS3绿色荧光蛋白表达,显微镜观察发现细胞形态改变,坏死细胞增多.转染组PIAS3 mRNA的积分密度值为523 414.50±34 502.89,与空白对照组的135 668.00±6 693.66和阴性对照组的154 511.67±8 266.89相比,转染组PIAS3 mRNA表达增强,x2=13.053,P=0.01.转染组PIAS3蛋白的积分密度值为30.13±3.76,与空白对照组的13.83±0.77和阴性对照组的15.02±0.87比较,CHG-5细胞转染PIAS3基因后,PIAS3蛋白表达增强,x2=14.193,P=0.001.提示转染后PIAS3 mRNA和蛋白表达增加.转染组的早期细胞凋亡率为(12.5±1.9)％,较空白对照组的(6.4土1.1)％和阴性对照组的(5.4±1.8)％升高,x2 =7.407,P=0.005;转染组的活细胞率为(86.9±2.2)％,较空白对照组的(92.1±1.2)％和阴性对照组的(93.1±2.0)％降低,x2=4.775,P=0.019.转染组S期细胞百分率为(35.2±4.2)％,高于空白对照组的(24.5士5.1)％和阴性对照组的(23.0±3.7)％,x2=8.179,P=0.003;转染组G2期细胞百分率为(10.7±5.4)％,高于空白对照组的(21.3±4.0)％和阴性对照组的(27.8±5.2)％,x2=17.121,P＜0.01.结论 外源性增强PIAS3表达,引起CHG-5胶质瘤细胞生长缓慢,出现S期阻滞,并促进细胞凋亡发生.
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PIAS3绿色荧光蛋白表达载体构建及其对胶质瘤U251细胞增殖和凋亡的影响
目的:构建PIAS3绿色荧光蛋白真核表达载体,探讨外源性PIAS3对胶质瘤细胞U251周期和凋亡的影响.方法:利用RT-PCR扩增人全长PIAS3编码序列,并将其克隆到带有绿色荧光蛋白的真核表达载体pEGF-P-N1中,得到重组质粒pEGFP-N1-PI-AS3.应用脂质体法转染体外培养的人胶质瘤U251细胞株.荧光显微镜观察蛋白表达,用RT-PCR和Western blot检测PIAS3的表达,Annexin V2 FITC和PI双染流式细胞术检测细胞凋亡,流式细胞术检测细胞增殖周期变化.结果:转染PIAS3基因的细胞株外源目的基因和蛋白表达增强,瞬时转染48 h后,光镜下可见部分细胞变圆,部分细胞脱落死亡;对照组和未转染组无明显变化.流式细胞仪分析显示,pEGFP-N1-PIAS3转染组凋亡细胞增多,细胞凋亡率显著高于未转染组和pEGFP-N1转染组,P＝0.007 3;U251细胞转染pEGFP-N1-PIAS3后细胞周期阻滞于S期,S期细胞比例增高,P＝0.025,G2期细胞比例降低.结论:外源性PIAS3使U251阻滞在S期,诱导胶质瘤细胞凋亡.
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RNAi抑制PIAS3表达对胶质瘤U251细胞增殖和凋亡的影响
目的：构建针对PIAS3的RNAi质粒载体，初步探讨抑制PIAS3表达对胶质瘤U251细胞增殖和凋亡的影响。方法：构建3个RNAi载体，用脂质体法将其转染胶质瘤细胞系CHG-5，通过半定量RT-PCR筛选干扰效率高的重组RNAi质粒。将该RNAi质粒转染体外培养的人胶质瘤U251细胞株，用半定量RT-PCR和Western blot检测PIAS3的表达。Annexin V2 FITC和PI双染流式细胞术检测细胞凋亡，流式细胞术检测细胞增殖周期变化。结果：转染干扰质粒的细胞株PIAS3基因和蛋白表达均有减弱。流式细胞仪分析，抑制PIAS3表达能够诱导胶质瘤U251细胞拮抗凋亡（P<0.01），同时出现细胞周期改变，表现为G2期细胞比例升高，S期细胞比例降低，具有显著性差异（P<0.05）。结论：下调PIAS3基因表达使U251阻滞在G2期，拮抗细胞凋亡。
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胶质瘤中STAT3通路及其负调控因子PIAS3活化状态和生物学效应的分析
目的：探讨STAT3信号通路及其负调控因子PIAS3在胶质瘤细胞中的活化状态及生物学效应。方法采用免疫组织化学方法检测胶质瘤中p?STAT3及PIAS3的活化状态；STAT3通路抑制剂60μmol/L AG490作用胶质瘤U118、U87细胞24、48 h， MTT法观察U118、U87细胞增殖能力的变化；免疫荧光检测AG490作用前后细胞p?STAT3及PIAS3蛋白表达的变化。结果 p?STAT3及PIAS3在不同级别胶质瘤细胞胞质和胞核内的表达无统计学差异，但在细胞核内p?STAT3和PIAS3的表达呈负相关；AG490处理细胞后，U118细胞数量无明显改变，U87细胞则表现为生长抑制。免疫荧光结果显示，AG490处理后，U118细胞p?STAT3和PIAS3表达水平均无显著改变，U87细胞p?STAT3核内表达下调，PIAS3出现明显核易位。结论 PIAS3通过核易位调控STAT3信号通路的活性，抑制胶质瘤细胞生长。
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PIAS3的Myc融合蛋白真核表达重组质粒的构建
目的:构建PIAS3(活化型STAT3抑制蛋白)的Myc融合蛋白真核表达重组质粒,并表达融合蛋白Mye-PIAS3.方法:采用PCR方法,扩增鼠PIAS3基因全长cDNA编码区序列.将该1 851 bp的特异性片段连接到T载体上,将其亚克隆至pCMV-Myc真核表达载体的Sal Ⅰ和Not Ⅰ位点之间.将pCMV-Myc-PIAS3重组质粒转染前列腺癌PC3细胞,利用Myc抗体通过Western blotting法检测融合蛋白Myc-PIAS3的表达.结果;重组pCMV-Myc-PIAS3质粒通过酶切和测序鉴定了其正确性.EcoR 1酶切鉴定时有4 357和1 318 bp2条带,Xba Ⅰ酶切鉴定时有3 291 bp和2 384 bp 2条带,与预期结果一致.测序结果显示,13个氨基酸Myc在N端,然后是阅读框架正确的PIAS3的基因序列.pCMV-Myc-PIAS3重组质粒转染PC3细胞,利用Myc抗体通过Western blotting法检测融合蛋白Myc-PIAS3的表达,在相对分子质量68 000处检测到特异的蛋白表达条带.结论:成功构建pCMV-Myc-PIAS3重组质粒,并表达融合蛋白Myc-PIAS3.
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PIAS3的表达与人脑胶质瘤恶性程度的关系
目的 探讨PIAS3表达与胶质瘤分化程度的关系.方法 收集病理确诊的30例不同恶性程度胶质瘤以及5例正常脑组织手术标本,采用光镜、免疫组化方法检测PIAS3表达水平;提取总微小RNA,应用实时荧光定量PCR技术验证PIAS3在人不同级别脑胶质瘤组织和正常脑组织中的表达,进行比较对照研究.结果 PIAS3在正常脑组织中高表达,在人脑胶质瘤中表达均明显降低,两者之间存在显著性差异(P<0.01).PIAS3人脑胶质瘤中表达水平呈随胶质瘤级别Ⅰ级,Ⅲ级和Ⅳ级(实体)组织增高而降低趋势,但在Ⅳ级(瘤中心坏死)组织中表达无明显下降,部分甚至高于正常脑组织中表达(P<0.05).PIAS3在胶质瘤级Ⅱ级和Ⅲ级,Ⅲ级和Ⅳ级(实体)组织中的表达均有明显差异(P<0.01).结论 PIAS3在胶质瘤组织中低表达并与胶质瘤级别呈负相关,提示其与胶质瘤的发生、发展密切相关.
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PIAS3过表达抑制人脑胶质瘤U251细胞生长
目的 探讨PIAS3 过表达对人脑胶质瘤U251 细胞生长的作用及其可能的机制.方法 通过实时荧光定量PCR 检测PIAS3 在正常脑细胞和脑胶质瘤U251 细胞中的表达情况.转染PIAS3 过表达载体,提高U251 细胞中PIAS3 表达水平,通过噻唑蓝(MTT)试验检测细胞增殖情况.Western Blot 验证PIAS3 表达与增殖相关基因PI3K 及Akt 间关系.结果 PIAS3 在正常脑组织中相对高表达,而在人脑胶质瘤U251 细胞中表达明显下降(P ＜0.01).体外转染PIAS3 过表达载体能明显抑制U251 细胞生长,并且有效抑制PI3K 活性及p-Akt 表达,但对总的Akt 无明显影响.结论 胶质瘤U251 细胞中异常低表达的PIAS3 发挥着重要的增殖促进作用,过表达PIAS3 可通过抑制PI3K/Akt 通路有效抑制U251 细胞增殖.
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PIAS3在结肠癌组织和细胞中的表达及意义
[目的]观察PIAS3在结肠癌组织及细胞中的表达,探讨PIAS3在结肠癌发生发展中的作用.[方法]采用免疫组织化学染色法检测60例结肠癌及同源癌旁组织中PIAS3蛋白的表达,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、Western blot检测人结肠癌SW480 、SW620及CO-LO205细胞株中PIAS3 mRNA及蛋白表达水平.[结果]结肠癌组织中PIAS3蛋白表达显著高于癌旁正常组织(x2=8.543,P=0.006);且表达强度随肿瘤病理分化程度的降低、Dukes分期的增高及肿瘤体积的增大而逐渐增高,差异有统计学意义(P均＜0.05);PIAS3在结肠癌SW480、SW620及COLO205细胞株中均有表达,其中COLO205细胞株中PIAS3蛋白及mR-NA表达高于SW480和SW620细胞株(P＜0.05).[结论]PIAS3的表达水平以及活性与结肠癌的发生发展有关,可能为结肠癌的早期诊断及靶向治疗提供新的分子靶点.
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PIAS3抑癌效应研究进展
肿瘤是一种基因病,涉及到癌基因的激活和/或抑癌基因的失活.在这些基因中,某个或某些基因可能起了关键作用,其通过对下游细胞信号分子或网络的影响,进一步影响细胞的增殖和凋亡过程,造成失控性细胞增殖,终形成肿瘤.
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PIAS3在人脑胶质瘤中的表达
目的 通过观察PIAS3(protein inhibitor of activated STAT3)在不同级别胶质瘤中的表达,研究PIAS3表达与胶质瘤分化程度的关系.方法 运用免疫组织化学法对50例胶质瘤标本及5例正常脑组织中PIAS3的表达进行对照研究.结果 正常脑组织中未见PIAS3表达,胶质瘤标本中的总阳性率为56%(28/50),两者之间差异有显著性(P＜0.01);不同病理级别的阳性率和标记指数随着肿瘤恶性程度的升高而增加,但Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级胶质瘤PIAS3阳性率无明显差异(P＞0.05),Ⅰ～Ⅲ级与Ⅳ级阳性率之间有显著差异(P＜0.01);Ⅰ级与Ⅱ级的标记指数之间、Ⅲ级与Ⅳ级的标记指数之间均无明显差异(P＞0.05),低度恶性组(Ⅰ～Ⅱ级)与高度恶性组(Ⅲ～Ⅳ级)之间有显著差异(P＜0.05).结论 PIAS3在胶质瘤中有表达,并与肿瘤的病理分级和恶性程度密切相关,提示其可能参与了胶质瘤的发生、发展.
