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自噬抑制联合吉非替尼对MDA-MB-468细胞敏感性的影响
目的 自噬是细胞内的一种溶酶体降解过程,通过降解损伤的蛋白以及衰老的细胞器来维持细胞稳态,也是肿瘤治疗耐药性产生的原因之一.本实验探讨自噬抑制剂联合吉非替尼(gefitinib,GE)对人三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer,TNBC) MDA-MB-468细胞敏感性的影响.方法 常规复苏、传代培养MDA-MB-468细胞,待细胞处于对数生长期后分别以GE单药或联合自噬抑制剂3-methyladenine(3MA)或联合bafilomycin A1 (BAF)处理细胞.MTT比色法检测细胞相对增殖率,克隆形成实验检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡,蛋白质印迹法检测自噬相关蛋白的表达.结果 自噬抑制剂明显增加GE的细胞毒性,MTT比色法检测GE联合3MA、BAF处理MDA-MB-468细胞48 h后半抑制率(IC50)分别为(4.1±0.2)和(3.8±0.3)μmol/L,显著低于单用GE组的(7.0±0.2) μmol/L,Z=-2.611,P＜0.017.克隆形成实验显示,GE与自噬抑制剂联合3MA、BAF克隆形成率分别为(29.85±5.54)％和(33.58±6.31)％,显著低于单用GE组(63.46±8.32)％,Z=-2.309,P＜0.017.细胞凋亡的研究显示,自噬抑制可促进细胞凋亡,GE联合3MA、BAF后,凋亡率分别为(23.37士2.71)％、(18.71±2.81)％,高于单用GE组(12.43±3.18)％,Z=-2.309,P＜0.017.蛋白质印迹法检测结果显示,GE处理诱导自噬增加,自噬抑制剂联合GE后,MDA-MB-468细胞Cleaved Caspase-9和Cleaved Caspase-3蛋白的活性增加.结论 自噬抑制可增加MDA-MB-468细胞对GE的敏感性,自噬抑制剂联合GE可能通过启动Caspase级联反应促进MDA-MB-468细胞凋亡.
关键词： 乳腺肿瘤 自噬抑制 吉非替尼 MDA-MB-468细胞 -
自噬抑制剂可增强三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-468和MDA-MB-231对吉非替尼的敏感性
目的：观察自噬抑制剂能否增强三阴性乳腺癌（ TNBC）细胞系MDA?MB?468和MDA?MB?231对表皮生长因子受体（ EGFR）抑制剂吉非替尼的敏感性。方法以吉非替尼单药或联合自噬抑制剂3?甲基腺嘌呤（3?MA）或巴弗洛霉素A1（BAF）处理MDA?MB?468和MDA?MB?231细胞，以及雌激素受体阳性的MCF?7细胞，采用四甲基偶氮唑蓝（ MTT）法检测细胞增殖，流式细胞术检测细胞凋亡，Western blot法检测自噬标记蛋白以及凋亡通路相关蛋白的表达。结果吉非替尼对吉非替尼＋3?MA组和吉非替尼＋BAF组MDA?MB?468细胞的半数抑制浓度（IC50）分别为（4．1±0．2）μmol／L和（3．8±0．3）μmol／L，均明显低于吉非替尼组MDA?MB?468细胞[（7．0±0．2）μmol／L，均P＜0．05]。吉非替尼对吉非替尼＋3?MA组和吉非替尼＋BAF组MDA?MB?231细胞的IC50分别为（9．7±0．1）μmol／L和（7．7±0．2）μmol／L，均明显低于吉非替尼组MDA?MB?231细胞[（14．7±0．1）μmol／L，均P＜0．05]。吉非替尼组、吉非替尼＋3?MA组、吉非替尼＋BAF组MDA?MB?468细胞的凋亡率分别（12．43±3．18）％、（23．37±2．71）％和（18．71±2．81）％，吉非替尼联合自噬抑制剂3?MA或BAF时，MDA?MB?468细胞的凋亡率均明显高于单用吉非替尼时的凋亡率（均P＜0．05）。吉非替尼组、吉非替尼＋3?MA组、吉非替尼＋BAF组MDA?MB?231细胞的凋亡率分别为（12．15±1．82）％、（16．94±2．19）％和（33．83±5．92）％，吉非替尼联合自噬抑制剂3?MA 或 BAF 时， MDA?MB?231细胞的凋亡率均明显高于单用吉非替尼时的凋亡率（均P＜0．05）。吉非替尼联合3?MA或BAF对MCF?7细胞的凋亡无明显影响（ P＞0．05）。吉非替尼联合3?MA或BAF后，MDA?MB?468和MDA?MB?231细胞中p?PTEN的表达明显增加，LC3和p?Akt蛋白表达明显下调，cleaved caspase?9和cleaved caspase?3蛋白的活性增加。结论自噬抑制剂可能通过激活PTEN／PI3K／Akt 通路相关蛋白的表达增强MDA?MB?468和MDA?MB?231细胞对吉非替尼的敏感性；自噬抑制剂联合吉非替尼可能通过启动caspase级联反应促进MDA?MB?468和MDA?MB?231细胞凋亡。
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腺病毒载体介导的p53基因可增强乳腺癌细胞系MDA-MB-468对表皮生长因子受体抑制剂的敏感性
目的 观察腺病毒载体介导的p53基因(Ad-p53)能否增加三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB468对表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂吉非替尼的敏感性.方法 以Ad-p53和(或)吉非替尼处理MDA-MB-468细胞系,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot法检测p53和EGFR蛋白的表达以及PI3K/Akt通路和凋亡通路相关蛋白的表达.建立裸鼠移植瘤模型,观察Ad-p53联合吉非替尼对裸鼠移植瘤的治疗作用,免疫组织化学法检测裸鼠移植瘤组织中p53的表达.结果 MTT法检测结果显示,Ad-p53感染MDA-MB-468细胞后,MDA-MB-468细胞对吉非替尼的敏感性增加,半数抑制浓度为4.5 μmol/L.流式细胞术检测结果显示,对照组、Ad-p53组、吉非替尼组和联合组MDA-MB-468细胞的凋亡率分别为8.5％、17.4％、20.5％和32.6％,Ad-p53联合吉非替尼能够明显增加细胞凋亡(P＜0.05).Western blot法检测结果显示,Ad-p53联合吉非替尼后,MDA-MB-468细胞中p-Akt蛋白的表达明显下调(P＜0.01),caspase-9和活化caspase-3蛋白的活性增加(均P＜0.01).裸鼠体内实验的结果显示,Ad-p53组、吉非替尼组和联合组的肿瘤生长抑制率分别为35.7％、28.7％和74.4％,Ad-p53和吉非替尼对MDA-MB-468细胞裸鼠移植瘤的生长均具有抑制作用,且二者联合可明显抑制肿瘤生长(均P＜0.05).免疫组化检测结果显示,对照组、Ad-p53组、吉非替尼组和联合组裸鼠移植瘤肿瘤组织中p53蛋白的阳性率分别为45.2％、80.1％、50.7％和90.6％,Ad-p53组和联合组裸鼠移植瘤中p53蛋白的表达明显增加(P＜0.01).结论 Ad-p53可能通过下调PI3 K/Akt通路相关蛋白的表达增加MDA-MB-468细胞对吉非替尼的敏感性;Ad-p53联合吉非替尼可能通过启动caspase级联反应促进MDA-MB-468细胞凋亡.
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黄芪注射液对basal-like型乳腺癌细胞MDA-MB-468增殖的影响
目的:观察黄芪对basal-like乳腺癌细胞MDA-MB-468和小鼠骨髓基质干细胞(murine bone marrowstromal stem cells,mMSCs)增殖的影响及其异同.方法:用不同浓度的黄芪注射液(Astragalus injection,AI)分别干预MDA-MB-468和mMSCs,不加AI培养2 d的MDA-MB-468细胞作为空白对照.用相差倒置显微镜观察细胞形态,透射电子显微镜观察细胞超微结构.运用细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)检测AI对MDA-MB-468的细胞毒性作用.流式细胞术检测AI对细胞周期和细胞凋亡的影响.酶比色法监测MDA-MB-468细胞培养上清乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)含量.免疫细胞化学法检测AI对MDA-MB-468表皮生长因子受体(epider-mal growth factor receptor,EGFR)和p53蛋白表达的影响.结果:1 g/ml AI对MDA-MB-468的增殖有明显的抑制作用,且具有时效关系.1 g/ml AI对mMSCs的增殖有明显的抑制作用,但其抑制作用不及顺铂,而0.1 g/ml AI对mMSCs的增殖有明显的促进作用.不同浓度的AI能诱导MDA-MB-468细胞凋亡.不同浓度AI组和顺铂组MDA-MB-468细胞培养上清LDH水平,与空白对照组相比,差异均无统计学意义.AI能显著下调EGFR和p53蛋白的表达.结论:AI对MDA-MB-468和mMSCs增殖的影响与药物浓度有关,其抑制MDA-MB-468增殖和诱导凋亡的机制可能通过下调EGFR和p53蛋白的表达而实现.
关键词： 黄芪注射液 乳腺癌 MDA-MB-468细胞 细胞增殖 小鼠 -
miR-424通过靶向调控HMGA1对乳腺癌细胞放疗敏感性的影响
目的:探讨miR-424/高迁移率蛋白A1基因(nigh mobility protein A1,HMGA1)分子轴对乳腺癌细胞放疗敏感性的影响及其分子机制.方法:收集2014年4月至2017年4月无锡市第四人民医院肿瘤放疗科经手术切除的50例乳腺癌患者的癌组织标本,用qPCR和Western blotting检测miR-424和HMGA1 mRNA与蛋白在乳腺癌放疗敏感患者和放疗抵抗患者癌组织中的表达水平.用不同辐射强度(0、2、4、6和8 Gy)的60Coγ-射线处理人乳腺癌细胞株MDA-MB-468后,观察细胞miR-424和HMGA1的表达变化.向MDA-MB-468细胞中转染miR-424 mimic/inhibitor和pcDNA-HMGA1,采用平板克隆形成实验、MTT法、Transwell小室法和Annexin V-FITC/PI染色流式细胞术检测miR-424对辐射处理后乳腺癌细胞增殖、侵袭和凋亡的影响.用双荧光素酶报告基因验证miR-424与HMGA1的靶向关系.结果:与放疗抵抗的乳腺癌患者比较,miR-424在放疗敏感的乳腺癌患者癌组织中高表达(P＜0.01),HMGA1低表达(P＜0.01).与0、2和4 Gy处理组细胞比较,6和8 Gy的γ-射线处理后乳腺癌MDA-MB-468细胞凋亡率和miR-424的表达水平显著升高(均P＜0.01);细胞的侵袭能力和HMGA1的表达水平显著降低(均P＜0.01).双荧光素酶报告基因证实miR-424靶向作用HMGA1并下调其表达水平.miR-424通过靶向下调HMGA1显著抑制MDA-MB-468细胞的增殖、侵袭并促进细胞凋亡(均P＜0.01),进而上调MDA-MB-468细胞对放疗的敏感性.结论:miR-424/HMGA1分子轴可调控乳腺癌放疗敏感性,过表达miR-424可增强乳腺癌MDA-MB-468细胞对γ-射线放疗的敏感性.
关键词： 乳腺癌 MDA-MB-468细胞 微小RNA-424 高迁移率蛋白A1基因 放疗敏感性 增殖 侵袭 凋亡 -
基底样乳腺癌中microRNA-205靶向调控KLF12及对细胞侵袭能力的影响
目的 探讨基底样乳腺癌(basal-like breast carcinoma,BLBC)特异性miRNAs和靶基因及生物学功能.方法 提取细胞总RNA和蛋白,荧光素酶实验验证靶基因;采用qRT-PCR、Western blot和免疫组化EnVision法分析miRNA和靶基因表达;CCK8和Transwell实验检测细胞增殖和侵袭能力.结果 荧光素酶实验示miR-205靶向调控KLF12(P =0.001 6).qRT-PCR检测结果示MAD-MB-468细胞中miR-205表达下调(P=0.007),KLF12表达升高(P=0.039);转染miR-205 mimics过表达miR-205,miR-205表达显著升高(P=0.000),KLF12表达减少(P =0.038).Western blot检测结果示miR-205过表达,MDAMB-468细胞KLF12表达显著升高(P=0.007 9).CCK8实验示miR-205未参与细胞增殖.Transwell实验示过表达miR-205显著抑制细胞侵袭能力(P =0.001).结论 miR-205是BLBC特异性的miRNA,通过负性靶向调控原癌基因KLF12和抑制侵袭具有抑癌基因的功能.miR-205和KLF12为BLBC的诊断和治疗提供潜在的分子标志物和新思路.
关键词： 乳腺肿瘤 microRNA-205 KLF12 MDA-MB-468细胞 侵袭 增殖 -
MK-2206与顺铂协同抑制人三阴性乳腺癌MDA-MB-468细胞增殖的研究
目的 研究Akt抑制剂MK-2206对顺铂抗人三阴性乳腺癌MDA-MB-468细胞增殖的影响.方法 CCK-8法分析MK-2206对MDA-MB-468细胞的增殖抑制作用.Western blot检测MK-2206单独或联合顺铂对MDA-MB-468细胞内Akt磷酸化水平、凋亡相关基因Bax/Bcl-2及MDA-MB-468细胞质内细胞色素C蛋白表达水平的影响.Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡.使用Chou-Talalay中位效应与联合指数模型分析药物联合效应.结果 MK-2206对MDA-MB-468细胞增殖具有抑制作用,且呈剂量和时间依赖性,其24 h的半数抑制浓度(IC50)为11.23 μmol/L.过表达组活化的Akt能够将顺铂对MDA-MB-468细胞的24 hIC50从1.12 μmol/L提高到1.75 μmol/L,显著拮抗顺铂对MDA-MB-468细胞的增殖抑制效应.2μmol/LMK-2206可显著抑制MDA-MB-468细胞内Akt激酶活性,表现为Akt Thr308和Ser473磷酸化水平显著下降;顺铂处理不影响MDA-MB-468细胞内Akt磷酸化水平.单独使用2μmol/L MK-2206处理MDA-MB-468细胞24 h不能诱导MDA-MB-468细胞凋亡,2μmol/L MK-2206可促进顺铂诱导的MDA-MB-468细胞内细胞色素C从线粒体向细胞质的转移和上调Bax基因表达、下调Bcl-2基因表达,显著促进细胞凋亡发生.结论 MK-2206与顺铂产生药物协同效应抑制MDA-MB-468细胞增殖,并促进顺铂诱导的MDA-MB-468细胞凋亡.
关键词： AKT抑制剂 MK-2206 顺铂 三阴性乳腺癌 MDA-MB-468细胞 -
三氧化二砷抑制人乳腺癌MDA-MB-468细胞生长及其机制的研究
背景与目的:探讨三氧化二砷(As2O3)对人乳腺癌MDA-MB-468细胞的生长抑制作用及其对syk表达的影响.材料与方法:采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测不同浓度As2O3作用MDA-MB-468细胞不同时间后,对细胞增殖的抑制作用;显微镜观察细胞的形态变化;As2O3作用细胞后用流式细胞术检测细胞周期及Syk蛋白表达变化;RT-PCR检测syk mRNA的表达变化.结果:As2O3可显著抑制MDA-MB-468细胞增殖,且抑制效应呈剂量和时间依赖性(P＜0.05);As2O3,可使细胞周期阻滞在S+G2/M期;候选抑癌基因syk在乳腺癌MDA-MB-468细胞中表达,经As2O3作用后,MDA-MB-468细胞syk mRNA和Syk蛋白表达水平明显升高(P＜0.05).结论:As2O3可能通过上调候选抑癌基因syk的表达,抑制MDA-MB-468细胞增殖,从而发挥抗肿瘤作用.
关键词： As2O3 人乳腺癌细胞 MDA-MB-468细胞 细胞凋亡 Syk
