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真核表达载体PcDNA3.0-AIF△1-480构建及其促凋亡活性的研究
目的:构建AIF截短后只保留羧基端促凋亡结构域的真核表达载体,了解其是否有促凋亡活性作用及其机制.方法:通过PCR方法构建出AIF截短体AIF△1-480的真核表达载体.采用脂质体将该载体瞬时转染人乳腺癌细胞系MCF-7细胞,采用流式细胞技术检测其对肿瘤细胞凋亡的诱导作用,同时采用JC-1流式细胞技术检测其对线粒体膜电位的影响.选取5～7周龄BALB/c雌性裸鼠35只,构建荷瘤裸鼠模型,并在体内实验中检测该载体的促凋亡活性作用.结果:成功构建真核表达载体PcDNA3.0-AIF△1-480,并经酶切鉴定和DNA测序证明.在体外实验中,与对照组相比该载体能够诱导MCF7细胞发生凋亡,对照组、PcDMA3.0组和PcDNA3.0-AIF△1-480组凋亡率分别为0.01％、16.01％和28.55％.同时MCF7细胞转染该载体后能够使线粒体膜电位发生去极化,导致凋亡的发生,对照组、PcD-MA3.0组和PcDNA3.0-AIF△1-480组凋亡率分别为2.26％、60.37％和95.78％.在荷瘤裸鼠模型中,转染该栽体后能够抑制肿瘤的生长,至观察终点中位肿瘤体积分别为1 187.2、1 000.0和609.4 mm3.结论:截短后只保留羧基端的AIF仍然有促凋亡活性作用,其机制是通过改变线粒体膜电位来发挥促凋亡作用.
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转录因子NF-YA真核表达载体的构建及转染HeLa细胞中的表达
目的:构建pAAV-NF-YA真核表达栽体并转染子宫颈癌HeLa细胞,检测NF-YA的表达水平.方法:抽提人类胚胎干细胞和胚胎成纤维细胞的总RNA,RT-PCR获得NF-YA基因的cDNA,克隆至pAAV-MCS载体中,经限制性酶切和测序鉴定后,重组质粒pAAV-NF-YA转粢HeLa细胞,Western Blot检测NF-YA的表达.结果:成功构建了NF-YA的真核表达载体,转染HeLa细胞后NF-YA的表达水平有显著提高.结论:获得了有效的pAAV-NF-YA真核表达载体,为后续NF-Y的功能研究提供了便利.
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sTRAIL真核表达载体的构建及其对C6胶质瘤细胞增殖影响的体外实验研究
目的 构建重组基因表达栽体PcDNA-sTRAIL并观察其对C6胶质瘤细胞的抑制作用.方法 通过PCR扩增和定向克隆技术构建重组真核表达栽体PcDNA-sTRAIL.以阳离子脂质体介导转染C6胶质瘤细胞并用流式细胞仪观测时细胞增殖的影响.结果 经过测序鉴定和蛋白表达检测证实,重组真核表达载体PcDNA-sTRAIL构建成功.阳离子脂质体介导质粒转染C6胶质瘤细胞阳性率达50%.脂质体PcDNA-sTRAIL转染C6细胞后,相比未转染、空质粒转染、Lipofectin转染组C6胶质瘤细胞增殖抑制、细胞凋亡明显增加(t分别:9.52、7.20、2.84,P均＜0.05).结论 成功构建了sTRAIL基因的真核表达载体,并从体外实验中初步证实了其对C6胶质瘤细胞增殖具有明显的抑制作用.
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人表皮生长因子真核表达载体的鉴定
目的:鉴定人表皮生长因子的真核表达载体.方法:重组体进行限制性酶切及PCR可见目的片段.结果:pCDDA3.1-hEGF真核表达载体已成功构建.结论:已成功构建hEGF真核表达载体,为进一步研究hEGF的功能奠定了基础.
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Exendin-4真核表达载体的构建及其在毕赤酵母中的表达
目的:构建Exendin-4基因真核表达裁体,并在巴斯德毕赤酵母GS115中进行表达,为大量获得Exendin-4奠定基础.方法:采用重叠聚合酶链反应法扩增出Exendin-4的完整序列,将其亚克隆到表达载体pPIC9K上,得到重组质粒pPIC9K-Exendin-4.重组质粒经Sac Ⅰ线性化后用电穿孔法导入到GS115中,经组氨酸缺陷筛选、G418高拷贝筛选及摇瓶表达筛选,甲醇诱导表达后用凝胶电泳法分析Exendin-4的表达.结果:序列测定结果表明成功地构建了毕赤酵母表达栽体,电泳结果证明Exendin-4在毕赤酵母中能高效表达.结论:实现了Exendin-4单体在毕赤酵母中的表达,为Exendin-4的规模化生产奠定了基础.
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OX40-IgG1融合基因重组表达载体的构建及鉴定
目的:构建含人OX40-IgG1融合基因的真核表达载体pDC315-0X40Ig,表达具有生物学活性的OX40Ig融合蛋白,为诱导异体复合组织移植免疫耐受的基因治疗作准备.方法:全基因合成目的基因OX40Ig,即人0X40胞外段序列及人IgG1 Fc段序列,将该片段插入到pUC57(+)载体后,亚克隆至真核表达载体pDC315(+),构建pDC315-0X40Ig重组质粒.构建的重组质粒经PCR、酶切及测序鉴定后,用脂质体法转染于NIH/3T3细胞.以SDS-PAGE与Western Blotting检测细胞培养上清中OX40Ig融合蛋白的表达情况;MTT法观察OX40Ig对混合淋巴细胞反应(MLR)的抑制作用.结果:合成的目的基因全长1320bp,构建的重组质粒经PCR,双酶切及测序鉴定正确.SDS-PAGE与Western Blotting证实OX40Ig融合蛋白在3T3细胞中实现表达,表达产物相对分子量为48000左右,与理论预期值相符.体外实验证实OX40Ig蛋白能够抑制异基因淋巴细胞的MLR.结论:成功构建了人OX40-IgG1融合基因真核表达载体pDC315-OX40Ig,体外实验证实表达的OX40Ig蛋白可抑制淋巴细胞增殖,为干预同种异体复合组织移植排斥反应奠定了基础.
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凋亡抑制基因survivin真核表达载体的构建及其在SHG44细胞中的表达
目的:克隆细胞凋亡抑制蛋白基因survivin(SVV)的编码序列,构建含SVV基因的真核细胞表达载体并观察其在人胶质瘤细胞系SHG44中的表达.方法:利用逆转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)扩增SVV基因编码序列,扩增产物双酶切后定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中,成功构建SVV基因真核表达载体pcDNA3.1-SVV.通过脂质体介导用pcDNA3.1-SVV转染SHG44细胞,经G418筛选,RT-PCR、免疫蛋白印迹(Western Blot)和免疫细胞化学方法鉴定SVV的表达.结果:经酶切鉴定和核苷酸序列分析,证实成功构建了SVV基因真核表达载体pcDNA3.1-SVV.蛋白和RNA水平检测表明SVV基因在SHG44细胞中稳定表达.结论:真核表达载体pcD-NA3.1-SVV使SVV基因在SHG44细胞中稳定表达.
