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真核表达载体PcDNA3.0-AIF△1-480构建及其促凋亡活性的研究
目的:构建AIF截短后只保留羧基端促凋亡结构域的真核表达载体,了解其是否有促凋亡活性作用及其机制.方法:通过PCR方法构建出AIF截短体AIF△1-480的真核表达载体.采用脂质体将该载体瞬时转染人乳腺癌细胞系MCF-7细胞,采用流式细胞技术检测其对肿瘤细胞凋亡的诱导作用,同时采用JC-1流式细胞技术检测其对线粒体膜电位的影响.选取5～7周龄BALB/c雌性裸鼠35只,构建荷瘤裸鼠模型,并在体内实验中检测该载体的促凋亡活性作用.结果:成功构建真核表达载体PcDNA3.0-AIF△1-480,并经酶切鉴定和DNA测序证明.在体外实验中,与对照组相比该载体能够诱导MCF7细胞发生凋亡,对照组、PcDMA3.0组和PcDNA3.0-AIF△1-480组凋亡率分别为0.01％、16.01％和28.55％.同时MCF7细胞转染该载体后能够使线粒体膜电位发生去极化,导致凋亡的发生,对照组、PcD-MA3.0组和PcDNA3.0-AIF△1-480组凋亡率分别为2.26％、60.37％和95.78％.在荷瘤裸鼠模型中,转染该栽体后能够抑制肿瘤的生长,至观察终点中位肿瘤体积分别为1 187.2、1 000.0和609.4 mm3.结论:截短后只保留羧基端的AIF仍然有促凋亡活性作用,其机制是通过改变线粒体膜电位来发挥促凋亡作用.
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Survivin蛋白和AIF在胃癌组织中的表达
目的 探讨Survivin和AIF在胃癌组织中的表达及对胃癌诊断和预后评估的价值.方法 应用免疫组化方法检测我院56例胃癌手术标本的Survivin和AIF的表达情况,并对这些患者进行随访.结果 Survivin和AIF在胃癌细胞中表达阳性率分别为71.43%(40/56)和66.07%(37/56),Survivin在癌旁组织和正常胃组织中无表达,AIF在癌旁组织和正常胃组织中低表达;Survivin和AIF在胃癌中表达无显著相关性;Survivin及AIF的阳性和阴性组1、3、5年累积生存率均有统计学差异.结论 Survivin和AIF在胃癌组织中的阳性表达率明显高于癌旁组织和正常胃组织,可以作为判断胃癌患者预后的指标,但二者的表达无明显相关性.
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癫痫清颗粒对戊四唑诱发大鼠癫痫模型的影响
目的 观察癫痫清颗粒对戊四唑诱发大鼠慢性癫痫模型的影响.方法 大鼠腹腔注射10 g·L-1戊四唑(40 mg·kg-1),隔日1次,连续4周,停药1周后,再次注射相同剂量的戊四唑,根据癫痫发作级别随机分为7组每组10只,连续灌胃给药治疗四周,末次给药1 h后除空白对照组外各组大鼠腹腔注射10 g·L-1戊四唑(40 mg·kg-1),记录各组大鼠癫痫发作级别,并通过HE染色观察癫痫清颗粒对戊四唑诱发大鼠慢性癫痫模型海马组织结构的影响,并通过免疫组化染色及免疫印迹法观察癫痫清颗粒对戊四唑诱发大鼠慢性癫痫模型海马组织凋亡因子表达的影响.结果 癫痫清颗粒组癫痫发作级别显著低于模型对照组,与模型对照组相比癫痫清颗粒可显著降低大鼠脑海马CA1区AIF和BaX的表达,与模型对照组相比癫痫清颗粒可显著增加大鼠脑海马CA1区Bcl-X/S+L的表达.结论 癫痫清颗粒对戊四唑诱发大鼠慢性癫痫模型具有呈剂量依赖性的保护作用.
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PUMA基因对HELA的作用及其机制的初步研究
目的 初步探讨PUMA基因对HELA细胞是否具有促凋亡的活性和其参与HELA细胞凋亡的过程线粒体中cyt-c、AIF位置足否发生迁移.方法 倒置相差显微镜、AO/EB染色检测PUMA基因的促凋亡活性;Western blot检测HELA细胞凋亡后线粒体中cyt-c、AIF位置是否发生迁移.结果 ①倒置相差显微镜和荧光显微镜结果显示转染PUMA基因后HELA细胞出现了一系列凋亡形态学改变,这种变化在转染48h比24h更明显;②Western blot结果显示HELA细胞凋亡后线粒体内膜腔隙蛋白cyt-c、AIF向胞质迁移,迁移的蛋白量在转染48h比24h更明显.结论 ①PUMA基因有促进HELA细胞凋亡的作用;②AIF和cyt-c参与PUMA基因促进HELA细胞凋亡的过程,但此过程有无涉及线粒体膜电位的变化还有待进一步的研究.
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KATP通道开放剂对氧糖剥夺诱导的SH-SY5Y细胞凋亡及AIF信号通路的影响
目的 观察K.通道开放剂对氧糖剥夺诱导SH-SY5Y细胞凋亡的影响,并进一步探讨KATP通道开放剂对凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor,AIF)信号通路的影响.方法 取传代后3d的SH-SY5Y细胞,分为A组(正常对照组)、B组(氧糖剥夺组)、C组(二氮嗪处理组)、D组(二氮嗪+5-羟葵酸处理组).采用MTT方法检测细胞活力,应用流式检测细胞凋亡,应用Western-blot及免疫荧光染色检测AIF蛋白表达变化及移位.结果 与正常对照组细胞相比,氧糖剥夺后细胞活力明显降低,100及200μmol/L的二氮嗪处理以后细胞活力明显升高,200μmol/L二氮嗪升高细胞活力更明显.与正常对照组细胞相比,氧糖剥夺后细胞凋亡率明显增高,二氮嗪处理以后细胞凋亡率明显下降.A,B,C,D四组AIF蛋白总量表达无显著性的差异(P＞0.05);在正常对照组,AIF蛋白以胞浆表达为主,氧糖剥夺导致AIF发生了明显的细胞核转移,二氮嗪处理显著减少氧糖剥夺诱导的AIF发生的细胞核转移.结论 KATP通道开放剂二氮嗪能明显增加氧糖剥夺后SH-SY5Y细胞活力,减少细胞凋亡,减少氧糖剥夺诱导的AIF发生的细胞核转移.
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线粒体与细胞凋亡的研究进展
线粒体是细胞凋亡的调控中心.在线粒体途径细胞凋亡过程中,线粒体结构和功能发生重构,线粒体外膜通道形成,导致一系列凋亡蛋白如Cyt C、AIF、EndoG、Omi/HtrA2、Smac/DIABLO等从线粒体释放到胞浆中,通过激活caspase或者抑制内源性凋亡抑制蛋白而发挥促凋亡作用.
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丙泊酚在脑缺血再灌注中对凋亡诱导因子核转位的影响
目的 研究丙泊酚是否能降低凋亡诱导因子(AIF)线粒体核转位,阻止Caspase非依赖性神经元凋亡,从而起到脑保护作用.方法 Wistar大鼠60只随机分为假手术组(S组)、缺血再灌注组(I/R组)、抑制剂组(I组)、丙泊酚组(P组).S组大鼠仅接受手术而不遭受全脑缺血再灌注损伤打击;I/R组大鼠采用二血管夹闭法制造缺血模型10 min,然后再灌注;I组大鼠在缺血前2min经静脉注入Caspase抑制剂;P组大鼠在全脑缺血再灌注前1h,经股静脉持续泵注丙泊酚持续1h,之后注入抑制剂,2min后建立全脑缺血再灌注损伤模型.缺血再灌注后6、24、48 h,取海马组织用流式细胞仪测细胞凋亡率、Western blot法分析AIF线粒体核转位、凋亡相关基因Bax、Bcl-2的表达情况.结果 与I/R、S、I组相比,P组神经元凋亡率显著降低,Bax/Bcl-2比值显著降低,AIF蛋白表达水平明显减少.结论 丙泊酚对脑缺血再灌注损伤的脑保护作用可能与抑制海马神经元中AIF线粒体核转位有关.
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氯化锂对人神经母细胞瘤细胞氧糖剥夺模型PARP/AIF凋亡信号通路的影响
目的 研究氯化锂对人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)氧糖剥夺模型的保护效果,并探讨其对多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)/凋亡诱导因子(AIF)凋亡信号通路的影响.方法 取传代2d的SH-SY5Y细胞分为三组:正常对照组、氧糖剥夺组和锂剂处理组,采用TUNEL染色观察各组细胞凋亡情况.Western印迹检测各组细胞质、细胞核中PARP-1 p85片段、AIF蛋白的表达.结果 TUNEL染色可见锂剂处理组凋亡细胞较氧糖剥夺组明显减少(P＜0.05).Western印迹检测显示胞质内PARP-1 p85片段没有表达,AIF各组表达无差异;在胞核中锂剂处理组PARP-1 p85片段、AIF的表达比氧糖剥夺组少(P＜0.05).结论 锂剂对氧糖剥夺模型的SH-SY5Y细胞具有较强的保护作用,其作用机制之一可能是通过抑制PARP-1活性,从而减少AIF发生核移位.
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亚低温通过抑制两种凋亡通路对大鼠脑缺血再灌注损伤发挥保护作用
目的探讨亚低温对大鼠局灶性脑缺血再灌注后胱冬酶(caspase)依赖性及非依赖性两种凋亡通路的影响.方法线栓法建立大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)及再通模型,分为假手术组、常温及亚低温脑缺血再灌注组,应用RT-PCR技术检测再灌注后不同时相缺血侧皮层凋亡诱导因子(AIF)及caspase-3 mRNA的表达.结果脑缺血2h再灌注2～4h,AIF及caspase-3 mRNA表达开始增加,随着再灌注时间的延长表达逐渐增强,至再灌注24h达高峰.每一再灌注时间点亚低温组与常温组AIF及caspase-3 mRNA表达均有显著差异,亚低温组 mRNA表达均低于相应常温组.结论亚低温不仅降低caspase依赖性通路中的关键蛋白酶-caspase-3的 mRNA的表达,而且降低caspase非依赖性通路中的关键蛋白-AIF的 mRNA的表达,亚低温通过抑制两种凋亡通路对大鼠脑缺血再灌注损伤发挥保护作用.
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人尿激肽原酶对大鼠脑缺血再灌注后神经细胞凋亡的影响
目的 观察人尿激肽原酶(HUK)对大鼠脑缺血再灌注(I/R)后大脑皮质缺血灶周围区Caspase-3、凋亡诱导因子(AIF)的时相表达及对神经细胞凋亡的影响.方法 将Wistar大鼠随机分为假手术组、模型组、HUK干预组,应用线栓法建立大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)再灌注模型.假手术组于术后,模型组、HUK干预组于缺血2h后冉灌注6h、24h、48h、72h,应用免疫组化技术和原位末端标记法(TUNEL)检测不同时相各组缺血灶周围脑区Caspase-3、AIF和TUNEL阳性细胞的表达.结果 大鼠I/R后在缺血灶周围区各个时间点均可见到Caspase-3、AIF和TUNEL阳性细胞的表达,HUK组与模型组相比较,两组Caspase-3、AIF和TUNEL阳性细胞的表达趋势基本一致,Caspase-3、AIF和TUNEL的表达高峰均在I/R后24h.HUK组各时间点Caspase-3、AIF和TUNEL阳性细胞的光密度值较模型组明显降低(均为P＜0.05).结论 HUK对大鼠脑缺血再灌注损伤有保护作用,其作用机制可能与HUK抑制Caspase-3、AIF的表达,减轻迟发性神经元的凋亡有关.
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吸氧预处理对大鼠脑缺血再灌注损伤AIF核转移的抑制作用
目的 探讨吸氧预处理对大鼠脑缺血再灌注损伤凋亡诱导因子(AIF)核转移的影响,揭示吸氧预处理治疗的分子机制.方法 将78只SD大鼠随机分为3组:缺血再灌注组、吸氧预处理组、假手术组.缺血再灌注组用线栓法制作大鼠大脑右侧中动脉阻塞模型,2h后实现再灌注.吸氧预处理组术前24 h持续吸入100％纯氧24 h.假手术组除不插入线栓外其它步骤同模型组.按再灌注时间再分为12h、24 h、48 h组,用免疫组织化学和免疫印迹(Western-blot)法,检测缺血侧海马CA1区AIF核移位情况.结果 免疫组化染色和Western blot检测可见吸氧预处理组和缺血再灌注组在不同时间点AIF蛋白发生核移位,AIF阳性细胞数及AIF蛋白含量较缺血再灌注组减少,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 吸氧预处理对脑缺血再灌注损伤神经细胞保护作用,其机制之一可能是对AIF核移位的抑制.
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线粒体调控细胞凋亡的相关研究综述
细胞凋亡是指为维持内环境的稳定,由基因调控的细胞自主、有序的死亡,又称程序性细胞死亡[1].细胞凋亡是一件主动的过程,它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等过程,是为了更好适应生存环境而主动采取的一种死亡过程.它在生物体的进化、内环境的稳定以及多个系统的发育中起着重要作用,且凋亡过程的紊乱可能与许多疾病的发生有直接或间接的关系.因此,有关细胞凋亡过程的研究,已成为生物学及医学研究的一个热点,引起越来越多人关注.
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丹红注射液对脑细胞AIF表达及神经元凋亡的影响
目的:探讨丹红注射液对脑缺血再灌注后脑细胞凋亡诱导因子(AIF)表达以及神经元凋亡情况的影响.方法:将20只大鼠随机分为假手术组2只,脑缺血再灌注组9只,丹红注射液组9只.建立脑缺血再灌注动物模型,并于再灌注24h、48h、72h时分别检测脑缺血再灌注组和丹红注射液组大鼠的AIF阳性和神经细胞凋亡阳性情况.结果:假手术组大鼠术后24h脑组织切片AIF检测未见阳性,脑缺血再灌注组术后24hAIF阳性数极显著高于丹红注射液组(P＜0.01),术后48h显著高于丹红注射液组(P＜0.05),术后72h两组无显著差异(P＞0.05).假手术组神经元凋亡检测未见阳性,脑缺血再灌注组24h凋亡量明显高于丹红注射液组(P＜0.05),48h和72h两组无显著差异(P＞0.05).结论:丹红注射液有助于减少脑缺血再灌注后的神经元凋亡,提高对缺血脑细胞的保护作用,拮抗神经元凋亡的佳时机在灌注的24h内.
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局部亚低温对大鼠局灶性脑缺血再灌注后凋亡相关因子的影响
目的 研究局部亚低温对大鼠局灶性脑缺血再灌注后caspase-3、凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor,AIF)、Fas的影响,探讨亚低温对脑缺血再灌注损伤的保护机制.方法 线栓法建立大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)及再通模型,分为假手术组、常温及亚低温脑缺血再灌注组,应用RT-PCR技术检测再灌注后不同时相缺血侧皮层caspase-3、AIF、Fas的表达.结果 每一再灌注时间点亚低温组caspase-3、AIF及Fas的mRNA表达均低于常温组,并有显著性差异.结论 局部亚低温减少caspase依赖性通路中的关键蛋白酶caspase-3 mRNA的表达,减少caspase非依赖性通路中的关键蛋白AIF mRNA的表达,减少外源性胱冬酶激活途径中关键受体Fas mRNA表达,通过多个环节而抑制脑缺血再灌注后凋亡的发生,从而起到脑保护作用.
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电针对缺血再灌注大鼠海马区凋亡诱导因子及核酸内切酶G表达的影响
目的:观察电针对缺血再灌注大鼠海马区凋亡诱导因子(AIF)及核酸内切酶G(Endo G)表达的影响.方法:SPF级健康成年雄性大鼠随机分为模型组、假手术组、针刺1d组和针刺7d组,除假手术组外,其余各组大鼠建立缺血再灌注模型.造模成功后针刺组针刺大鼠水沟、内关穴,并使用电针仪刺激.针刺等处理完成后各组大鼠断头处死取材,运用TTC染色技术观察脑梗死体积百分比,运用western blot技术观察AIF和Endo G的蛋白表达.结果:缺血再灌注后,模型组、针刺1d组、针刺7d组大鼠脑组织内AIF及Endo G的表达均较假手术组明显升高(P<0.01);针刺1d组、针刺7d组大鼠脑组织内AIF和Endo G的表达较模型组明显降低(P<0.01),其中针刺7d组上述指标又明显低于针刺1d组(P<0.05).结论:电针能够有效降低脑梗死大鼠海马区AIF及Endo G蛋白的表达,且效果与治疗次数呈正相关.
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亚低温对大鼠脑缺血/再灌注海马神经元p-JNK,AIF的影响
目的 通过动态观察亚低温对SD大鼠全脑缺血海马神经元半胱氨酸蛋白激酶-3(Caspase-3),凋亡诱导因子(AIF),p-JNK表达的影响,探讨亚低温对脑保护的可能机制.方法 10～12周龄的成年雄性SD大鼠,参照Pulsinelli 等[1]的四血管阻断法制作全脑缺血模型,随机分为假手术组,全脑缺血再灌损伤组,亚低温再灌注组,每组根据再灌注不同时间点(2 h,1 d,3 d,7 d)制取海马标本,观察其组织形态学变化;免疫组化检测AIF,p-JNK;TUNEL染色检测海马区神经元凋亡;Caspase-3荧光活性检测.结果 假手术组各时间点无变化,缺血再灌注两组海马神经元凋亡在CA1区都从再灌注2 h开始,且在1 d达到高峰后回落,其中亚低温组在(1 d,3 d)明显降低了Caspase-3、AIF、p-JNK的活性,增加了存活细胞(P<0.05).结论 亚低温可显著减少SD大鼠缺血性海马神经元再灌注后凋亡的发生,其机制可能与抑制海马P-JNK的活化,减弱Caspase-3活性,同时通过非Caspase-3通路减少AIF的表达相关.
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干预代谢途径抑制缺氧/复氧诱导肥大心肌细胞凋亡——依赖及非依赖性Caspase的作用
目的 阐明干预肥大心肌细胞代谢途径转化防治缺血再灌注所致细胞凋亡的作用及其分子机制.方法 应用血管紧张素Ⅱ(0.1 mol·L-1)诱导培养小鼠心肌细胞肥大,在三气孵箱中进行缺氧/复氧处理模拟缺血再灌注.缺氧/复氧前,分别给予无药物干预及DCA(1 mmol·L-1)、TMZ(5 μmol·L-1)、LC(50 μmol·L-1)、AA(10 μmol·L-1)预处理.葡萄糖和脂肪酸氧化代谢率采用放射性计数法测定.RT-PCR和Western Blot法分别测定细胞色素C和凋亡诱导因子mRNA和蛋白质表达水平.分光光度法测定Caspase-3活性.Hoechst 33258染色检测细胞凋亡百分数.结果结果表明,缺氧12 h及复氧4 h后肥大心肌细胞葡萄糖氧化代谢率均显著降低,而脂肪酸氧化代谢率显著升高,DCA、TMZ、LC均可明显抑制缺氧/复氧后葡萄糖氧化代谢的下降,明显抑制缺氧/复氧后葡萄糖氧化代谢的升高,AA使缺氧/复氧后肥大心肌细胞葡萄糖氧化代谢率的进一步降低和脂肪酸氧化代谢率进一步升高.同时,DCA、TMZ、LC均可明显抑制线粒体细胞色素C和AIF mRNA和蛋白质表达水平,明显抑制细胞色素C和AIF蛋白的核转位,抑制caspase-3活性,而AA作用相反.DCA、TMZ、LC明显抑制缺氧/复氧后肥大心肌细胞凋亡率,而AA作用相反.结论 上述结果提示,干预肥大心肌细胞代谢途径通过抑制线粒体凋亡蛋白表达、释放有效防治肥大心肌细胞凋亡.
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戊四唑急性癫痫模型海马病理组织的变化
目的：观察大鼠戊四唑急性癫痫模型造模后不同时间海马神经元损伤程度的变化。方法大鼠腹腔注射10 g· L －1（64 mg·kg －1）戊四唑1次，诱发大鼠急性癫痫发作，分别于注射戊四唑后24、72、120、144 h 将大鼠麻醉，灌流取脑，采用尼氏染色及免疫组化染色观察大鼠海马神经元损伤程度。结果与空白对照组相比，腹腔注射戊四唑后海马神经元损伤程度随着时间的延长逐渐加重。结论戊四唑急性致痫模型大鼠海马神经元损伤的大差异出现在腹腔注射戊四唑后120 h 附近，可以将其作为药效学研究的海马组织取材时间。
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凋亡相关蛋白在扁平苔藓中的表达
目的：：检测扁平苔藓皮损中核因子κB( NF－κB)和凋亡诱导因子( AIF)的表达。方法：采用免疫组化法和脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的原位缺口末端标记技术检测25例扁平苔藓患者皮损和25例健康皮肤组织中AIF和NF－κB的积分光密度值( IOD)和角质形成细胞的凋亡指数( AI)。结果：扁平苔藓组NF－κB和AIF的积分光密度值均高于健康对照组(P<0.01),扁平苔藓中角质形成细胞的凋亡指数显著高于健康对照组,两组比较差异具有统计学意义( P<0.01)。 NF－κB的阳性表达强度与自身角质形成细胞的凋亡指数不存在相关性(r＝0.13,P>0.05),扁平苔藓组AIF的阳性表达强度与其自身的角质形成细胞的凋亡指数呈正相关( r＝0.64,P<0.01)。结论： AIF可能参与了扁平苔藓角质形成细胞的细胞凋亡。
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AIF及AIF依赖的细胞凋亡
AIF是一种线粒体蛋白,具有氧化还原酶和诱导细胞凋亡两种活性.AIF从线粒体到细胞核的转位足以介导体外细胞凋亡的发生,而且是以非caspases依赖的方式进行的.AIF的诱导凋亡活性是小鼠胚胎形态发生过程中类胚体成腔所必需的,也参与了神经细胞的细胞凋亡.真菌、线虫等的细胞凋亡也有AIF同源分子的参与.因此,AIF介导的细胞凋亡代表了独立于caspase信号通路之外的另一条更原始、更保守、更普遍的凋亡途径.
