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谷胱甘肽巯基转移酶对肿瘤化疗药物耐药的影响
肿瘤对化疗药物的内源性或获得性的耐药是目前肿瘤化疗失败的重要原因.耐药现象产生的原因有多种:多药耐药相关蛋白表达变化,药物代谢或摄取发生变化,药物靶标分子的突变、增殖或凋亡关键基因(如p53)的改变造成细胞逃避凋亡,药物解毒酶如谷胱甘肽巯基转移酶(glutathionine S-transferase,GST)的过表达等[1-3].本文就GST对肿瘤化疗耐药性的影响的相关研究作一综述.
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洛伐他汀克服吉非替尼耐药与整合素β1、Survivin的相关性分析
目的 研究洛伐他汀克服吉非替尼耐药与整合素β1、Survivin的相关性,并探讨其可能机制.方法 将吉非替尼耐药的非小细胞肺癌(NSCLC)细胞株PC9分为4组:无药对照组(RPMI 1640培养液培养)、吉非替尼组(1 μmol/L吉非替尼)、洛伐他汀组(5μmol/L洛伐他汀)和吉非替尼与洛伐他汀联合组(1μmol/L吉非替尼+5 μmol/L洛伐他汀).各组细胞分别用相应药物处理后,采用CCK-8法检测细胞的增殖抑制率,PCR法检测细胞中整合素β1、Survivin mRNA的表达水平,蛋白质印迹法检测整合素β1、Survivin蛋白的表达水平.结果 与无药对照组、洛伐他汀组及吉非替尼组相比,洛伐他汀与吉非替尼联合组对吉非替尼耐药PC9细胞增殖的抑制作用增强(P＜0.01),细胞中整合素β31、Survivin mRNA及蛋白的表达水平降低(P＜0.01).结论 洛伐他汀联合吉非替尼克服吉非替尼耐药是通过阻断整合素β31-p-Akt-Survivin信号通路来实现的,有望成为克服吉非替尼耐药的一种有效策略.
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IFN-γ和TNF-α诱导间充质干细胞促进结肠癌细胞的化疗抵抗
目的 观察炎症因子干扰素γ(interferon-γ,IFN-γ)和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-a,TNF-a)诱导间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)对结肠癌细胞化疗抵抗的影响及机制.方法 应用炎症因子IFN-γ和TNF-α联合处理MSCs,收集条件培养上清,并将其作用于人结肠癌细胞系HCT116及HT29细胞,同时分别给予化疗药物顺铂和5-氟尿嘧啶处理.显微镜下观察各组细胞形态变化,MTT法和流式细胞术检测细胞增殖和凋亡情况,RT-PCR检测凋亡相关基因Bax和Bcl 2表达情况.结果 经化疗药物处理,与未经条件培养上清培养的细胞比较,经条件培养上清培养的细胞形态学改变更轻微,细胞增殖率增高(P＜0.05)、凋亡率降低(P＜0.05),Bcl-2 mRNA表达水平上调、Bax mRNA表达水平下调.结论 经炎症因子IFN-γ和TNF-α诱导的MSCs能够促进结肠癌细胞化疗抵抗能力.
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UbcH10基因沉默联合多柔比星抑制耐药乳腺癌细胞体内成瘤实验
目的 观察UbcH10基因沉默对多柔比星抑制耐药乳腺癌细胞株MCF-7/ADR体内成瘤作用的影响.方法 采用慢病毒系统在MCF-7/ADR细胞中进行UbcH10基因沉默.将基因沉默后的肿瘤细胞及对照肿瘤细胞接种至裸鼠皮下,通过裸鼠尾静脉连续给予多柔比星或生理盐水2周并停药1周,测量肿瘤体积,分析UbcH10沉默对多柔比星抑制MCF-7/ADR体内成瘤作用的影响.采用蛋白质印迹分析检测瘤体中的UbcH10及BCL-2蛋白含量,分析UbcH10与肿瘤细胞化疗敏感性之间的调控关系.结果 通过慢病毒实验系统成功建立UbcH10基因沉默细胞株MCF-7/ADR UbcH10-RNAi.经过3周给药处理,多柔比星组肿瘤体积与对照组比较差异无统计学意义,肿瘤抑制率为4.16％;基因沉默+多柔比星组肿瘤体积与对照组差异有统计学意义(P＜0.05),肿瘤抑制率为41.8％.瘤体内蛋白含量检测结果显示,对照组、多柔比星组、基因沉默+多柔比星组UbcH10蛋白表达量分别为0.81±0.16、0.78±0.12、0.18±0.04,基因沉默+多柔比星组其余两组比较差异均有统计学意义(P＜0.05);BCL-2蛋白表达量组间差异与UbcH10一致,二者之间具有正相关性.结论 UbcH10基因沉默可以显著增强多柔比星抑制耐药乳腺癌细胞MCF-7/ADR的体内成瘤作用.
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RNAi沉默polβ基因部分逆转食管鳞癌细胞顺铂耐药性
目的 通过RNA干扰(RNAi)技术沉默DNA聚合酶polβ的表达,观察其对食管癌细胞顺铂(cDDP)耐药性的影响.方法 构建靶向polβ基因的siRNA重组慢病毒pRNAT-U6.2/Lenti-polβ1、pRNAT-U6.2/Lenti-polβ2及阴性对照载体pRNAT-U6.2/Lenti-polβC,将其感染人食管鳞癌顺铂耐药细胞系EC9706/cDDP,通过RT-PCR、蛋白质印迹分析和免疫荧光实验观察细胞polβ的表达情况,采用MTT法观察不同浓度顺铂对细胞生长的抑制作用并计算50％细胞生长抑制所需的药物浓度(IC50)和耐药指数(RI).结果 靶向polβ的siRNA重组慢病毒pRNAT U6.2/Lenti polβ1和pRNAT-U6.2/Lenti-polβ2感染EC9706/cDDP后均可下调polβ的mRNA和蛋白表达水平,其中前者效果更为显著.顺铂以剂量依赖方式抑制EC9706/cDDP细胞增殖,感染pRNAT-U6.2/Lenti-polβ1、pRNAT-U6.2/Lenti-polβC的EC9706/cDDP细胞及未感染EC9706/cDDP细胞对顺铂的IC50分别为55.71、62.41、63.11 μg/mL,耐药指数分别为13.9、15.5、15.7,其中前者与后二者相比差异有统计学意义(P＜0.05).结论 polβ的表达与食管鳞癌细胞系EC9706/cDDP顺铂耐药性有关,沉默其表达可部分逆转EC9706/cDDP细胞对顺铂的耐药性.
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胰岛素样生长因子1在非小细胞肺癌EGFR-TKIs耐药机制中的作用
目的 探讨胰岛素样生长因子1(IGF-1)在表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)耐药的非小细胞肺癌(NSCLC)细胞株和患者中的表达和临床意义.方法 ELISA法检测PC9、A549、H1975细胞和患者血清IGF-1水平,蛋白质印迹和免疫细胞化学法检测细胞中胰岛素样生长因子结合蛋白(1GFBP)的表达;MTT法检测吉非替尼和IGF-1受体拮抗剂BMS536924处理后的细胞增殖;收集84例接受EGFR-TKIs治疗患者的临床资料,分析IGF-1表达与临床病理特征和生存期的相关性.结果 同吉非替尼敏感细胞株PC9相比,耐药细胞株H1975和A549中IGF-1表达增加(P＜0.05),IG-FBP表达降低;加入不同浓度的BMS536924可促进吉非替尼对耐药细胞株的增殖抑制(P＜0.05).在接受EGFR-TKIs治疗的患者中,疾病进展者的IGF-1水平较疾病控制者有所增高(P=0.052);原发性耐药者较获得性耐药者的IGF-1水平升高(P=0.02).IGF-1表达阴性患者的生存期高于阳性患者(P=0.002).结论 IGF-1在耐药NSCLC细胞株及患者血清中均有高表达,使用IGF-1R拮抗剂可逆转耐药细胞对EGFR-TKIs的反应;IGF-1表达与患者预后相关.
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ERα通路代偿性激活在乳腺癌细胞的拉帕替尼获得性耐药中的作用
目的 了解雌激素受体α(estrogen receptorα,ERα)通路代偿性激活在乳腺癌细胞BT474的拉帕替尼获得性耐药发生过程中的作用和可能机制.方法 利用real-time PCR和蛋白质印迹检测BT474被拉帕替尼作用后人表皮生长因子受体2 (HER2)通路和ERα通路活性的改变；利用拉帕替尼浓度递增、持续培养的方法建立乳腺癌细胞BT474的拉帕替尼获得性耐药细胞(rBT474)模型；采用流式细胞术检测拉帕替尼对rBT474细胞凋亡的影响,进一步以蛋白质印迹法分析BT474和rBT474在HER2通路和ER通路上的差别；应用MTT法检测rBT474在拉帕替尼和氟维司群作用下的生长情况；利用克隆形成实验观察双靶点治疗对预防拉帕替尼获得性耐药的可能性.结果 Real-time PCR和蛋白质印迹检测显示拉帕替尼抑制BT474细胞HER2磷酸化,同时诱导叉头蛋白3A (FOXO3a)和孕激素受体(PR)的表达升高；成功获得的耐药细胞株rBT474在含有5μmol/L拉帕替尼的培养液中仍可持续生长；蛋白质印迹结果显示,rBT474细胞与BT474细胞相比,其磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)通路受抑制,而促分裂素原活化蛋白激酶(MAPK)通路激活,ER通路的活化更加明显；MTT法检测结果显示,与单用拉帕替尼相比,联合使用拉帕替尼和氟维司群可抑制rBT474细胞活力(P＜0.01)；克隆形成实验结果表明,与二甲亚砜组、拉帕替尼组和氟维司群组相比,拉帕替尼和氟维司群联合用药组可抑制BT474细胞克隆形成(P＜0.01),具有预防获得性耐药发生的可能.结论 ERα通路的代偿性激活可能是导致HER2(+)/ERα(+)的乳腺癌细胞对拉帕替尼产生获得性耐药的机制之一,而PI3K/AKT抑制和MAPK激活可能是ERα代偿激活的主要原因.
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多西环素增加卵巢癌细胞HO8910对顺铂化疗敏感性
目的 探讨多西环素对卵巢癌的抗肿瘤作用及可能机制.方法 采用MTT方法检测多西环素单独作用及与顺铂联合用药时对卵巢癌细胞HO8910增殖的影响；采用RT-RCR检测卵巢癌细胞HO8910中CXCR4 mRNA的表达；采用蛋白质免疫印迹法检测多西环素作用后卵巢癌细胞HO8910中CXCR4表达的改变.结果 较低浓度多西环素(10 μg/mL)作用48 h后即可抑制卵巢癌细胞HO8910的增殖活力(P＜0.01),当其浓度为50μg/mL时抑制率达(70±2)％.多西环素与顺铂联合用药后对癌细胞的抑制效应大于同一浓度顺铂单独作用时,可提高癌细胞对顺铂的化疗敏感性.多西环素抑制卵巢癌细胞HO8910中CXCR4的表达.结论 多西环素对卵巢癌细胞HO8910有明确的抑制增殖作用,能增加癌细胞对顺铂化疗的敏感性.SDF-1/CXCR4通路可能参与其中.
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PTEN基因逆转白血病多因素多药耐药机制探讨
目的 研究分析野生型PTEN基因对多柔比星(阿霉素,ADM)耐药人红白血病细胞系K562/ADM多药耐药(MDR)逆转的作用机制.方法 将携带野生型PTEN基因的腺病毒载体(Ad-PTEN-GFP)或空载体(Ad-GFP)感染ADM耐药的K562/ADM细胞,流式细胞术检测感染效率,在感染3d内联合应用不同浓度的ADM、阿糖胞苷(Ara-C)或三氧化二砷(As2O3),通过MTT法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡率,根据IC50计算药物逆转倍数,观察PTEN基因对上述化疗药物MDR逆转作用.同时采用荧光定量PCR检测PTEN、NF-kB、MDR1、MDR相关蛋白(MRP)及凋亡相关基因Bcl-2、BcbxL及Bax水平变化,蛋白质印迹检测PTEN、Akt、p-Akt、P65水平变化.结果 以感染复数为200感染第3天后,Ad-PTEN-GFP感染与化疗药物联合作用组K562/ADM细胞增殖抑制率、凋亡率均高于Ad-GFP与化疗药物联合作用组(P＜0.05),PTEN感染能增加K562/ADM对ADM、Ara-C、As2O3的敏感性,逆转倍数分别为3.80、2.65、2.64.与Ad-GFP组相比,Ad-PTEN-GFP感染K562/ADM细胞3d后p-Akt与P65蛋白表达下调,NF-kB、MDR1、Bcl-2、Bcl-xL mRNA表达下调,Bax mRNA表达上调.结论 野生型PTEN基因可能通过抑制Akt信号转导通路进一步调控下游信号分子,通过下调NF-kB、MDR1、Bcl-2及上调Bax等多种信号分子逆转K562/ADM细胞的多药耐药.
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整合素β1信号通路参与非小细胞肺癌吉非替尼获得性耐药
目的 探讨整合素β1及其下游信号转导通路在非小细胞肺癌表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFRTKI)吉非替尼获得性耐药中的作用.方法 以人肺腺癌细胞株PC-9和吉非替尼耐药株pC-9/G作为研究对象,免疫印迹分析检测整合素β1、Akt、磷酸化Akt蛋白的表达；用MTT法检测吉非替尼和(或)磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)抑制剂LY294002、细胞外调节蛋白激酶(ERK)抑制剂PD98059对细胞增殖的影响；用Annexin V/PI试剂盒和TUNEL试剂盒检测细胞凋亡.结果 吉非替尼耐药株PC-9/G高表达整合素β1,RNA T扰抑制整合素β1表达能够抑制PC-9/G细胞的生长和促进凋亡.PC-9/G细胞中吉非替尼对Akt磷酸化的抑制作用弱于PC-9细胞,RNA干扰抑制整合素β1表达后Akt的磷酸化水平降低.ERK抑制剂PD98059不能恢复PC-9/G细胞对吉非替尼的敏感性,PI3K抑制剂LY294002能恢复PC-9/G细胞对吉非替尼的敏感性.结论 整合素β1过表达可以通过PI3K途径激活下游信号分子,这可能是一种重要的EGFR TKI耐药机制.
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耐紫杉醇肺癌细胞BNX动物模型的建立
目的 建立一种耐药性稳定的人肺癌BNX小鼠皮下移植瘤模型,为研究体内肿瘤耐药机制和逆转药物的筛选奠定实验基础.方法 将体外培养的对数生长期的肺癌耐药细胞株A549-Taxol,接种在免疫缺陷小鼠的皮下,形成肿瘤,采用肿瘤组织块或肿瘤组织原代培养的细胞,分别于动物皮下接种致瘤；体内外交叉进行致瘤,提高耐药细胞株A549-Taxol的致瘤率和缩短致瘤时间.通过免疫组化鉴定该耐药细胞的特性.用MTT法检测细胞的耐药指数.结果 耐药细胞接种于SCID小鼠4个月后在皮下形成肿瘤灶.用该肿瘤组织块或细胞悬液移植于SCID小鼠,通过反复3次后,细胞生长速度变快,2个月后皮下即可形成肿瘤.将该细胞移植于BNX小鼠,以同样的方法将瘤组织体内外交叉进行致瘤,终BNX小鼠种植成功率达到80％.致瘤时间为3周.耐药细胞和组织块P-gp170、GST-π和MMP-7均高表达.A549-Taxol细胞的紫杉醇半数抑制浓度(IC50)是亲代A549细胞的520倍.结论 初步建立了人肺腺癌耐药细胞(A549-Taxol)的动物模型,为肺癌临床个体化治疗及耐药逆转研究等提供了良好的实验动物平台.
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应用p75NTR分选食管肿瘤干细胞并鉴定其生物学特性
目的:应用p75NTR进行人食管肿瘤干细胞的分选,并对其生物学特性进行鉴定.方法:对人食管癌标本癌细胞及食管癌细胞株TE-1、Eca109进行培养,应用流式细胞仪检测p75NTR在人食管癌细胞(esophageal cancer cells,ECCs)中的表达,应用磁珠分选(MACS)法进行p75NTR阳性细胞与阴性细胞的分选,观察p75NTR阳性细胞的增殖、分化及软琼脂克隆形成能力,并进行裸鼠接种以观察其致瘤能力;应用化疗药物作用于ECCs后检测其中p75NTR阳性细胞与阴性细胞存活率,以评价p75NTR阳性细胞对化疗药物的耐受性.结果:8个食管肿瘤细胞系(株)中,除SHEC-1、SHEC-5未检测到p75NTR阳性细胞外,其余6个细胞系(株)SHEC-4、SHEC-6、SHEC-7、SHEC-8、Eca109、TE-1中均检测到p75NTR阳性细胞,阳性细胞比例分别为 2.71%、0.32%、3.35%、1.13%、2.15%、0.45%.与阴性及未分选细胞相比,MACS分选后的p75NTR阳性细胞具有较强的增殖能力,具有分化产生其他表型细胞的能力,在软琼脂中具有较强的克隆形成能力(P<0.01);行裸鼠接种时,p75NTR阳性细胞表现出较强的致瘤性,其中SHEC-7细胞只需2×103个即可致瘤,其致瘤能力是未分选细胞的50倍.化疗药物分别作用于p75NTR阳性细胞与阴性细胞48 h后,p75NTR阳性细胞的存活比例明显高于阴性细胞(P<0.05).结论:人食管肿瘤细胞中p75NTR阳性细胞具有自我更新、分化、增殖能力,对化疗药物具有较强的耐受性,并具有较强的致瘤能力,具有肿瘤干细胞的特性.
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钙黏蛋白与表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂治疗肝细胞癌敏感性的相关性
目的 探讨钙黏蛋白(E-cadherin)表达在表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)治疗肝细胞癌耐药形成中的作用.方法 选取常见的4种肝细胞癌细胞HepG2、BEL-7404、SK-HEP-1和MHCC97,用蛋白质印迹法检测这4种肝癌细胞中E-cadherin的蛋白表达,MTT法检测E-cadherin的表达与肝癌细胞EGFR-TKI治疗抑制率的相关性.结果 4种肝癌细胞中HepG2、BEL-7404表达E-cadherin呈阳性并对EGFR-TKI治疗敏感,PD153035和吉非替尼两种EGFR-TKI的药物浓度与肝癌细胞HepG2、BEL-7404的生存率之间存在相关性(P＜0.05);然而,肝癌细胞SK-HEP-1和MHCC97中E-cadherin表达阴性并对EGFR-TKI治疗耐药,PD153035和吉非替尼两种药物浓度与肝癌细胞MHCC97 、SK-HEP-1的生存率之间不存在相关性(P＞0.05).另外,E-cadherin表达阴性细胞SK-HEP-1转染E-cadherin目的基因后与转入空载体的肝癌细胞相比,EGFR-TKI治疗的敏感性上调(P＜0.05).结论 E-cadherin在调节EGFR分子靶向治疗的敏感性方面起重要作用.
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结肠癌干细胞生物学特性研究进展
结肠癌干细胞(colon cancer stem cells,CCSCs)在肿瘤发生、增殖、转移以及化学抵抗中发挥重要作用.目前关于CCSCs标记物的研究较多,而对CCSCs增殖、转移、化学抵抗等生物学行为机制的报道较少.本文就近几年CCSCs生物学特性的相关机制研究作一综述,尤其重点阐述microRNAs对CCSCs的调控作用,为临床改善和提高结肠癌的诊断和治疗水平提供参考.
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K-ras基因突变在肺腺癌发生及诊治中的新认识
K-ras基因突变常见于肺腺癌.研究认为吸烟是促发K-ras基因突变的重要因素,K-ras基因突变对肺腺癌亚型的演变及肺腺癌的预后产生影响.近年来K-ras基因的检测手段不断创新,大大提高了对肿瘤成分较少的病理组织的突变基因的检测率.目前认为K-ras基因突变会对抗表皮生长因子受体(EGFR)药物产生抗药性,并对化疗疗效产生一定的影响.因此,关于K-ras基因突变的诊断与靶向治疗的关系已成为国内外研究的热点.本文通过对近些年来有关K-ras基因突变与肺腺癌文献进行回顾,对伴有K-ras基因突变的肺腺癌的发生、诊断和治疗做一综述.
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指纹基因群分析揭示锯齿型结直肠癌的预后和耐药特性
目的 利用指纹基因群(GES)分析技术挖掘现有公共芯片数据揭示锯齿型结直肠癌的预后和耐药特性.方法 从基因表达谱数据储存公共平台(GEO)中下载4个有预后信息的结直肠癌表达谱芯片数据(GSE14333、GSE17538、GSE33113、GSE37892),用批间误差校正和单基因信息抽提等信息技术获得1个整合的表达谱队列(n=600).获得锯齿型结直肠癌表达谱有关数据及相应特异性指纹基因群,并与前面的表达谱队列合并,建立指纹基因群评分系统,依托已知锯齿型结直肠癌样本的基因群评分确定分组界值.根据分组界值,将600例结直肠癌分为锯齿型、过渡型和传统型结直肠癌组,利用Kaplan-Meier和Cox模型分析锯齿型结直肠癌的预后特征.同时,收集并下载与不可切除结直肠癌姑息治疗有关的表达谱数据(GSE28702、GSE5851),经表达谱数据抽提整理后,获得每个样本的锯齿型指纹基因群评分,通过比较治疗有效组和无效组之间评分的统计学差异来揭示锯齿型结直肠癌与药物耐药的关系.结果 根据结直肠癌亚型评分界值,600个结直肠癌中有50个被分为锯齿型,126个被分类为过渡型,424个被分为传统型.锯齿型和过渡型结直肠癌与传统型结直肠癌相比具有几乎完全相同的预后能力,多因素Cox模型发现锯齿型和过渡型结直肠癌是患者术后复发的独立危险因素.单纯比较锯齿型和传统型结直肠癌,多因素Cox模型发现锯齿型结直肠癌是患者预后的不良因素(AHR=1.792,95％CI 1.011～3.177).西妥昔治疗有效组的指纹基因群评分显著低于无效组(P=0.017),但FOLFOX治疗有效组和无效组的基因群评分无差异.结论 结直肠癌锯齿型亚型是结直肠癌患者术后复发的独立危险因素,且与西妥昔单抗治疗耐药相关.
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长链非编码RNA与肾癌靶向药物耐药
随着对肾癌发病机制的日渐了解,小分子靶向药物如舒尼替尼和索拉非尼等已经被广泛应用于临床,显著提高了肾癌患者的生存时间.然而,约有15％的进展期肾癌患者对靶向药物先天耐药,其余患者在接受舒尼替尼治疗6～15个月后也往往出现耐药和疾病进展,成为晚期肾癌治疗的瓶颈.因此,探索肾癌靶向耐药的生物学机制以及寻找预测靶向药物疗效的生物学标记物十分迫切.我们团队近期的研究发现了在肾癌靶向药物耐药过程中起关键作用的长链非编码RNA(lncRNA),相关研究成果发表在Cancer Cell、Nature Communications和Oncogene等国际知名期刊上.本文总结了我们团队关于肾癌靶向药物耐药研究的新成果,并对未来靶向药物耐药研究的方向和难点进行了探讨.
