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ΔNp63 shRNA表达质粒的构建及在膀胱癌中的作用
目的 构建ΔNp63特异性短发夹RNA(shRNA)的表达载体,探讨其在膀胱移行细胞癌(TCCB)细胞中的作用.方法 设计、合成ΔNp63特异性的短链寡核苷酸,克隆到Pgenesil-1质粒载体中,构建ΔNp63特异shRNA表达载体,转染TCCB细胞;免疫组化S-P法检测ΔNp63蛋白表达水平,半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测ΔNp63 mRNA的表达水平,流式细胞术(FCM)检测细胞周期,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖活性.结果 经PstⅠ和SalⅠ双酶切和测序鉴定,成功构建ΔNp63-shRNA质粒表达载体,并能够成功转染TCCB细胞.转染后可显著抑制细胞中ΔNp63蛋白和mRNA的表达,其中ΔNp63 mRNA的表达抑制率为63.0%;G0/G1期细胞显著增加,为(66.38±3.08)%,S期细胞显著减少,为(33.68±2.06)%;细胞增殖活性明显降低.结论 运用Pgenesil-1质粒载体构建的ΔNp63-shRNA表达载体可成功转染TCCB细胞,有效抑制ΔNp63蛋白和mRNA表达,并可调控TCCB细胞的细胞周期,抑制其增殖.
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ΔNp63、VEGF和PCNA在膀胱尿路上皮癌中的表达及其与肿瘤浸润和转移的关系
目的 探讨ΔNp63、VEGF和PCNA蛋白在膀胱尿路上皮癌组织中的表达及其与癌浸润、转移的关系.方法 用免疫组织化学方法检测ΔNp63、VEGF和PCNA的表达,并将三者的表达做相关性分析.结果 ΔNp63、VEGF和PCNA在肿瘤组织中的阳性表达率分别为78.7%、58.3%和84.3%;与对照膀胱组织相比,其表达显著增高,差异均有统计学意义(P < 0.01);且病理分级高级别、浸润性尿路上皮癌及有淋巴结转移的患者的阳性率显著高于病理分级低级别、浅表性尿路上皮癌及无淋巴结转移的患者,差异均有统计学意义 (P < 0.05).结论 ΔNp63、VEGF和PCNA的过表达与膀胱尿路上皮癌浸润转移相关,且三者在其浸润转移中关系密切.
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miR-203过表达对人瘢痕成纤维细胞增殖的影响
目的:探讨miR-203过表达对人瘢痕成纤维细胞增殖的影响及其机制.方法:组织块法培养原代人瘢痕成纤维细胞6、12、24和48 h;miR-203模拟物(miR-203 mimics)转染人瘢痕成纤维细胞并培养24 h;采用CCK-8检测细胞的存活率;流式细胞术Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡;双荧光素酶报告基因检测miR-203与p53基因家族成员截短型p63(ΔNp63)的靶标关系;qRT-PCR检测miR-203和△Np63 mRNA的表达水平;Western blotting检测ΔNp63和P53的蛋白表达水平.结果:miR-203在瘢痕成纤维细胞中表达明显降低(P＜0.01),且呈时间依赖性;转染miR-203 mimics后作用24 h,miR-203表达水平显著增加(P＜0.0l);miR-203过表达使细胞存活率降低至42％ (P ＜0.01),细胞凋亡率增高至45％ (P ＜0.01);miR-203与ΔNp63存在直接靶标关系;miR-203过表达可显著抑制ΔNp63的mRNA和蛋白表达水平,同时显著上调P53的蛋白表达水平(P＜0.01).结论:miR-203过表达可抑制人瘢痕成纤维细胞增殖,其机制可能是通过靶向抑制ΔNp63的表达进而上调P53的蛋白表达.
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P16INK4A、ΔNP63与Brn-3a作为宫颈上皮内瘤变标志物的研究
目的:探讨肿瘤抑制基因P16INK4A、凋亡相关基因异构体ΔNP63和细胞转录因子Brn-3a在各级宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)的TCT标本中的表达及其作为CIN生物标志物的可行性和临床意义.方法:利用SP免疫组化法检测71例TCT标本中P16INK4A和ΔNP63的表达;用RT-PCR法检测各标本中Brn-3a mRNA的转录,分析它们与CIN病理分级的关系.结果:各级病理学诊断中P16INK4A与ΔNP63阳性率分别为炎症(4.76%/4.76%),CINⅠ(89.47%/84.21%),CINⅡ(100%/100%),CINⅢ(100%/100%),各级CIN与炎症的P16INK4A和ΔNP63阳性率之间,差异有极显著性(P＜0.001),各级CIN的阳性率之间,差异无统计学意义(P＞0.05).Brn-3a的表达阳性率分别为炎症(0%),CINⅠ(5.26%),CINⅡ(50%),CINⅢ(90.48%),CINⅢ的Brn-3a阳性率明显高于与炎症、CINⅠ组(P＜0.01),炎症与CINⅠ、CINⅡ与CINⅢ比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论:P16INK4A、P63与Brn-3a可作为CIN的标志物,辅助细胞学筛查,Brn-3a可能成为间接反映CIN发展的生物学指标.
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PTEN，ΔNp63和 Ki-67在非肌层浸润性膀胱癌中的表达
目的：探讨PTEN，ΔNp63，Ki-67在非肌层浸润性膀胱癌（Ta，T1）中的表达与肿瘤分级、分期及预后之间的关系，为膀胱癌的临床诊断、治疗及预防复发提供参考依据。方法选取潍坊市寒亭区人民医院和青岛大学医学院附属医院泌尿外科，行经尿道膀胱肿瘤电切术患者的肿瘤组织标本110例。术后肿瘤组织标本均经病理检查明确诊断为非肌层浸润性膀胱移行细胞癌，其中Ta期68例，T1期42例；低度恶性潜能（ PUNLMP）20例，低级别（LG）61例，高级别（HG）29例。结果110例标本中PTEN阳性表达90．0％，ΔNp63阳性表达83．6％，Ki-67阳性表达83．6％．相关分析证明PTEN在T1期、高级别肿瘤中的表达较少，与肿瘤分期、分级呈负相关（P＜0．05），ΔNp63，Ki-67在T1期、高级别肿瘤中的表达明显，与肿瘤分期、分级呈正相关（P＜0．05）。结论PTEN，ΔNp63及Ki-67的阳性表达可为明确非肌层浸润性膀胱移行细胞癌的生物学行为以及判断肿瘤术后复发提供依据。
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兔角膜缘干细胞两种培养方法的比较
目的对采用消化法和组织块法培养兔角膜缘干细胞进行对比,以期确定合理的角膜缘干细胞体外培养方法.方法采用3T3成纤维细胞滋养层培养体系,分别用消化法和组织块法培养兔角膜缘上皮细胞,用免疫组织化学技术检测培养的细胞中ΔNp63的表达.采用流式细胞技术分析分离的角膜缘上皮细胞悬液中间质细胞的含量,采用扫描电镜观察去除上皮的角膜缘基质表面.结果采用消化法培养,培养的细胞中ΔNp63表达较多,细胞终可以分化为复层上皮结构.在分离的细胞悬液中,间质细胞含量小于5%,扫描电镜显示角膜缘上皮细胞能被完全消化.结论在角膜缘干细胞的培养中,在干细胞的含量方面,消化法培养要明显优于组织块法培养.
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ΔNp63 mRNA在膀胱癌组织中的表达及意义
目的 探讨ΔNp63 mRNA在膀胱移行细胞癌(TCCB)中的表达及意义.方法 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测48例TCCB患者肿瘤组织、10例对照膀胱组织ΔNp63 mRNA的表达,并分析ΔNp63 mRNA表达与TCCB临床分期、病理分级等的关系.结果 48例TCCB组织中ΔNp63 mRNA表达阳性率为75.0%(36/48),对照组膀胱组织中ΔNp63蛋白表达阳性率为0.0%(0/10), TCCB组ΔNp63 mRNA表达阳性率明显高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05).不同临床分期肿瘤组织中ΔNp63 mRNA表达阳性率、各组间ΔNp63 mRNA表达阳性率差异无统计学意义(P＞0.05).不同病理分级肿瘤组织中ΔNp63 mRNA表达阳性率、各组间ΔNp63mRNA表达阳性率差异无统计学意义(P＞0.05).结论 TCCB组ΔNp63 mRNA表达水平均明显高于对照组,提示ΔNp63与TCCB的发生密切相关,其可能为TCCB发生的重要促进因素,ΔNp63 mRNA表达水平和TCCB的临床分期、病理分级没有相关性,故ΔNp63在TCCB进展中的作用有待进一步研究.
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异丙酚对大鼠脑缺血再灌注后p63各亚型表达的影响
目的 探讨异丙酚对大鼠脑缺血再灌注后p63亚型(TAp63、ΔNp63)表达的影响.方法 将120只健康SD大鼠随机分为假手术(S)组、脑缺血/再灌注(I/R)组和异丙酚(PP)组,每组40只.分别于术后6h,1、3、5d处死三组大鼠,用免疫组化法检测TAp63、ΔNp63的表达,原位末端转移酶标记技术(TUNEL)检测神经元凋亡情况.结果 与S组比较,I/R组TAp63表达率于术后6h,1、3d逐渐增加,3d与1、5d比较,差异有统计学意义(P＜0.05);ΔNp63表达率在术后逐渐增加,各时间点比较差异均有统计学意义(P＜0.05) ;PP组TAp63表达较I/R组同时间点明显减少(P＜0.05),而ΔNp63表达较I/R同时间点增多(P＜0.05).I/R和PP组1、3、5d细胞凋亡指数较S组增加(P＜0.01) ;PP组较I/R组同时间点降低(P＜0.05),3d与1、5d比较,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 TAp63表达在I/R后呈先增加后减少趋势,与神经元凋亡趋势基本一致,提示TAp63可能参与了神经元的凋亡;PP具有一定的脑保护作用,其机制可能与下调TAp63、上调ΔNp63表达进而抑制神经元凋亡有关.
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p63与细胞凋亡的研究进展
p63基因是与p53基因高度同源的肿瘤抑制基因之一,具有与p53基因相似的结构和功能.本文就p63在细胞周期调控和细胞凋亡中作用的研究进展作一综述.
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ΔNp63、Ki-67在膀胱移行上皮癌的表达及意义
目的:探讨ΔNp63和Ki-67在膀胱移行上皮癌(transitional cell carcinoma of bladder,TCCB)中的免疫组化表达及与膀胱癌病理分级、临床病理分期和预后的相关性.方法:随机选择2006～2007年间56例TCCB和12例正常膀胱黏膜病理切片用SP免疫组化行ΔNp63和Ki-67检测,将结果与病理分级、分期和预后进行分析.结果:ΔNp63和Ki-67在膀胱移行细胞癌中的阳性表达率明显高于正常膀胱黏膜(P<0.05).ΔNp63和Ki-67在低分化、浸润性癌组织中的阳性表达率明显高于高分化、浅表性癌组织,在膀胱癌的病理分级和临床分期之间表达差异有统计学意义(P<0.05).ΔNp63和Ki-67在复发病例中的阳性表达率显著高于初发病例(P<0.05).采用Spearman等级相关性分析对ΔNp63和Ki-67在TCCB中的表达进行比较,ΔNp63与Ki-67呈正相关,rs'为0.316,且P<0.05.结论:ΔNp63和Ki-67与膀胱癌的临床病理分级和分期及预后密切相关,随膀胱癌分化程度的降低和浸润程度的增加而增强.ΔNp63和Ki-67在TCCB的进展中可能有相互协同作用,ΔNp63可能通过促进细胞增殖发挥促癌作用,联合检测ΔNp63和Ki-67可以作为判断TCCB的预后的肿瘤标记物.
