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超极化激活环核苷酸门控阳离子通道在脑缺血及其认知功能障碍中的作用
超极化激活环核苷酸门控阳离子(hyperpola rization activated cyclic nucleotide gated cation,HCN)通道属于一种特殊的电压门控离子通道.目前研究结果显示,HCN通道各亚型在基因和蛋白表达层面的变化对疾病的发生、发展及预后可产生极大影响,如参与神经系统的颞叶癫痫、神经病理性疼痛、脑缺血等疾病[1-2].HCN通道是由6个跨膜结构和一个单孔环结构构成,在超极化激活状态下介导内向阳离子电流,该电流早在兔的窦房结起搏活动中被发现,亦称If电流或I.电流.随后在感光细胞和海马CA1区锥体细胞中也有发现,称之为Ih电流,后来将这种介导Ih的离子通道命名为HCN通道[3].
关键词： 脑缺血 超极化激活环核苷酸门控阳离子通道 认知功能 综述 -
ZD7288抑制大鼠穿通纤维-海马CA3区通路的突触传递
目的观察HCN通道特异性阻滞剂ZD7288对大鼠海马CA3区突触传递的影响.方法应用在体电生理细胞外记录技术记录大鼠海马CA3区场电位,用HPLC荧光检测技术测定海马组织氨基酸含量,观察CA3区局部微量给予ZD7288和CsCl后对低频(0.5 Hz)刺激穿通通路(perforant pathway,PP)诱发的海马CA3区群峰电位(population spike,PS)幅度及海马组织氨基酸含量的影响.结果海马CA3区分别注射ZD7288(20,100和200nmol)和CsCl(1,5和10 μmol)可引起PS幅度剂量依赖性下降;药物效应于给药后5 min开始,作用维持时间90 min以上.给予ZD7288(100nmol)大鼠海马组织谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸及γ-氨基丁酸含量显著降低,与生理盐水对照组比较,差异有显著性意义(P＜0.01或P＜0.05).结论 ZD7288可显著抑制大鼠穿通纤维-海马CA3区突触传递,并可降低海马组织氨基酸含量.
关键词： ZD7288 超极化激活环核苷酸门控阳离子通道 场电位 氨基酸 海马 -
大鼠小肠缺血改变后电生理及HCN-1表达的变化
目的 观察胃肠道缺血性变化致小肠电生理及离子通道超极化激活的环化核苷酸门控通道亚型1(HCN-1)的变化,为探讨胃肠动力机制提供理论依据.方法 不完全结扎大鼠肠系膜前动脉方法制作小肠缺血大鼠模型.采用生理记录仪对小肠电活动的波幅和频率进行监测.采用免疫荧光组织化学双标记的方法,标记模型大鼠小肠C-kit与HCN-1,以及对相应缺血肠段进行HE染色.结果 缺血大鼠小肠比正常小肠电生理频率、波幅均有增强,HCN-1表达也有明显增高(P<0.05).结论 HCN-1在小肠黏膜和平滑肌间隙中存在,且其在胃肠道缺血状况下在小肠的表达明显增高,提示HCN-1可能在胃肠道的动力起搏调解方面起着较为重要的作用.
关键词： 超极化激活环核苷酸门控阳离子通道 缺血损伤 小肠 大鼠 -
链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠窦房结HCN通道表达的变化
目的 观察糖尿病对大鼠窦房结功能及超极化激活环核苷酸门控阳离子通道(HCN)表达的影响. 方法 选择3月龄健康雄性SD大鼠,随机分为链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)诱导糖尿病组和对照组,测定固有心率、窦房传导时间、窦房结恢复时间,观察两组间窦房结功能的差异;采用光标测技术识别窦房结组织,Westem blot检测HCN通道亚型HCN1、HCN2、HCN3、HCN4蛋白在大鼠窦房结中的表达. 结果 糖尿病大鼠静息心率及固有心率减慢,窦房传导时间和窦房结恢复时间延长,与对照组相比,具有统计学差异(P＜ 0.05);Western blot结果显示,大鼠窦房结组织存在HCN2和HCN4蛋白的表达,但是未检测到HCN1和HCN3蛋白的表达;与对照组相比,糖尿病组大鼠窦房结HCN2和HCN4蛋白表达量均显著减少,差异具有统计学意义(P＜0.01). 结论 STZ诱导糖尿病大鼠窦房结组织HCN2和HCN4蛋白表达减少,这可能是糖尿病相关窦房结功能障碍的分子机制之一.
关键词： 超极化激活环核苷酸门控阳离子通道 链脲佐菌素 糖尿病 窦房结 -
乳鼠窦房结细胞原代培养方法的优化
目的:对乳鼠窦房结细胞原代培养方法进行改进,并观察超极化激活环核苷酸门控阳离子通道(HCN4)在心脏细胞上的表达特点. 方法:取新生SD乳鼠的窦房结组织,在传统乳鼠窦房结细胞原代培养方法的基础上进行优化改进,选用0.1％胰蛋白酶与0.1％Ⅱ型胶原酶按照1∶1制成的混合消化酶,以减少窦房结自律细胞的损伤,混合酶消化后采用差速贴壁法及5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-Brdu)纯化处理.通过免疫荧光实验观察HCN4在乳鼠心脏细胞上的表达情况. 结果:(1)本方法培养的心脏细胞存活率为95.8％.(2)经差逮贴壁、5-Brdu处理,窦房结细胞所占比例明显提高.(3)培养3～5 d,视野中绝大多数为搏动的心脏细胞,成纤维细胞无明显增殖,可观察到梭形、三角形和不规则形3种细胞.其中梭形细胞所占比例高,其细胞器不发达,糖原颗粒不丰富,肌原纤维较少,搏动频率快,表达HCN4;三角形细胞微量表达HCN4. 结论:(1)混合消化酶结合差速贴壁及5-Brdu处理,可以显著提高细胞成活率及窦房结梭形细胞的比例,是可靠的窦房结细胞的分离纯化方法.(2)搏动频率快、细胞器不发达、糖原颗粒少、HCN4表达阳性的梭形细胞可能就是窦房结的起搏细胞.
关键词： 窦房结细胞 培养方法 差速贴壁 超极化激活环核苷酸门控阳离子通道 -
ZD7288抑制急性内脏痛大鼠痛觉敏化
目的:观察超极化激活环核苷酸门控阳离子通道(HCN通道)的特异性阻断剂ZD7288对急性内脏痛大鼠痛觉敏化的影响.方法:选用成年雄性SD大鼠,通过结肠内注射1％醋酸1 mL,建立急性内脏痛模型;免疫组织化学法检测HCN2在模型大鼠腰骶段背根神经节及胸腰段与腰骶段脊髓背角的表达;通过腹壁撤退反射评分和腹外斜肌放电测量,观察模型大鼠鞘内分别给予50与100 nmol/L ZD7288后内脏痛觉敏化是否发生改变.结果:HCN2在模型大鼠腰骶段背根神经节及胸腰段与腰骶段脊髓背角的表达均较对照大鼠增强(P＜0.05).鞘内注射50～100 nmol/L ZD7288可以剂量依赖性降低急性内脏痛模型大鼠的腹壁撤退反射评分和腹外斜肌放电幅值(P＜0.05).结论:ZD7288可抑制急性内脏痛大鼠的痛觉敏化,而背根神经节和脊髓的HCN2通道可能在其发病中起作用.
关键词： 内脏痛 背根神经节 脊髓 ZD7288 超极化激活环核苷酸门控阳离子通道 -
小肠缺血性改变引起HCN-1、SP及CGRP表达变化的研究
目的 观察小肠缺血性改变导致超极化激活的环核苷酸门控通道亚型1(HCN-1)与P物质(SP)、降钙素基因相关肽(CGRP)表达的变化,为探讨胃肠动力机制提供理论依据.方法在前期实验基础上,采用不完全结扎大鼠肠系膜前动脉方法制作小肠缺血大鼠模型,应用免疫荧光组织化学双标记的方法,观察变化高峰时段即造模第5天模型大鼠小肠HCN-1与SP、CGRP的表达情况.结果 小肠缺血性改变大鼠小肠比正常小肠SP、CGRP表达明显增高(P<0.05),且HCN1与SP和CGRP存在着递质共存.结论 SP、CGRP在小肠肌间神经丛表达,而在胃肠道缺血状况下表达明显增高,且HCN1与SP和CGRP存在递质共存,提示SP、CGRP可能作为神经递质在HCN1作为始发离子通道调节胃肠道动力起搏方面起着较为重要的作用.
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起搏通道HCN2基因稳定转染HEK293细胞的电生理特点
目的 了解超极化激活环核苷酸门控阳离子通道基因亚型HCN2(hHCN2)稳定转染人胚肾细胞(HEK293)的离子通道电生理特点.方法 采用全细胞膜片钳技术测定hHCN2稳定转染HEK293细胞的通道电流(IhHCN2)电生理特点. 结果 人全长起搏通道HCN2(hHCN2)基因稳定转染HEK293,记录到一系列超极化内向离子流,该电流激活缓慢,呈电压、时间依赖性,没有明显失活过程,激活电位、半大激活电位分别为-87±8 mV(P＞0.05)、-98±2 mV(n=20),激活时间常数为196±36 ms.起搏电流阻断剂ZD7288和Cs+灌流,IhHCN2峰值幅度均降低,半效抑制浓度分别为23.9±5.9 μmol/L、126.8±27.1 μmol/L,ZD7288的作用冲洗后抑制作用不能恢复,Cs+的作用在冲洗后基本恢复.结论 稳定转染HEK293细胞的克隆起搏通道hHCN2基因具有起搏电流的特点.
关键词： 电生理学 超极化激活环核苷酸门控阳离子通道 膜片钳 人胚肾细胞 -
起搏通道基因亚型HCN4重组腺病毒载体的构建及通道电流检测
目的旨在构建超极化激活环核苷酸门控阳离子通道基因亚型4(HCN4)重组腺病毒载体并鉴定其离子通道功能.方法全长人HCN4基因酶切后亚克隆到腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV,形成含目的基因和绿色荧光蛋白基因的穿梭载体.穿梭载体和病毒骨架载体pAdEasy-1经电穿孔法在BJ5183大肠杆菌中同源重组,重组后的腺病毒载体经PacⅠ酶切线性化后,利用脂质体介导转染到HEK293细胞进行病毒的包装和扩增.用多聚酶链反应(PCR)方法对病毒上清中的HCN4进行检测,并将重组腺病毒感染COS-7细胞,用免疫荧光染色检测HCN4蛋白质的表达,利用全细胞膜片钳方法测定转HCN4基因细胞的电生理功能.结果通过酶切、测序、PCR等证实HCN4通道基因重组腺病毒载体构建正确,免疫荧光检测证实转染AdHCN4的COS-7细胞中HCN4通道基因的表达,膜片钳实验也在转基因细胞中检测到超极化激活的非选择性内向阳离子电流(If).结论 HCN4通道基因重组腺病毒载体的构建成功为进一步研究该离子通道的电生理功能及在心律失常疾病基因治疗方面的潜在应用价值奠定了基础.
关键词： 分子生物学 超极化激活环核苷酸门控阳离子通道 起搏电流 腺病毒 -
超极化激活环核苷酸门控阳离子通道与临床疾病的研究进展
超极化激活环核苷酸门控阳离子通道(HCN)的功能,其生理特点,通过动物试验与心律失常,神经系统疾病与泌尿系统疾病的研究进展.
关键词： 超极化激活环核苷酸门控阳离子通道 心律失常 神经系统 -
大鼠脊髓背角胶状质神经元的去极化反跳及调控机制
目的 研究大鼠脊髓背角胶状质(SG)神经元的去极化反跳及调控机制,以期对去极化反跳相关疾病的临床治疗提供参考.方法 选取3～5周龄SD大鼠,制作离体脊髓纵切片,应用全细胞膜片钳技术记录SG神经元的电生理学特点及接受超极化刺激后的反应,并观察超极化激活环核苷酸门控阳离子(HCN)通道阻断剂和T型钙(Cav3)通道阻断剂对去极化反跳的作用.结果 共记录了63个SG神经元的电活动,其中23个无去极化反跳,19个为去极化反跳无放电,21个为去极化反跳伴放电.无去极化反跳组SG神经元的动作电位阈值(-28.7±1.6 mY)明显高于去极化反跳伴放电组(-36.0±2.0 mV)(P＜0.05).HCN通道阻断剂氯化铯和ZD7288可显著延长去极化反跳伴放电的潜伏期,分别从45.9±11.6 ms增加到121.6±51.3ms(P＜0.05)和从36.2±10.3 ms增加到73.6±13.6ms(P＜0.05);ZD7288也能显著延长去极化反跳不伴放电的潜伏期,从71.9±35.1 ms增加到267.0±68.8 ms (P＜0.05),而T型钙通道阻断剂氯化镍和米贝地尔可显著降低去极化反跳伴放电的振幅,分别从19.9±46.3 mV降到9.5±4.5 mV(P＜0.05)和从26.1±9.4 mV降到15.5±5.0mV(P＜0.05),米贝地尔同样能显著降低去极化反跳不伴放电的振幅,从14.3±3.0 mV降低至7.9±2.0 mY(P＜0.05).结论 近2/3的SG神经元有去极化反跳,其潜伏期和振幅分别受HCN通道和T型钙通道调控.
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HCN1通道基因敲除下调小鼠膀胱Cajal间质细胞中BK通道的表达及功能
目的 观察小鼠HCN1通道基因敲除对其膀胱Cajal间质细胞(interstitial cells of Cajal,ICCs)中BK通道的表达和功能的影响,探讨这种影响对膀胱兴奋性调控的意义.方法 健康清洁成年的野生型C57BL/6J小鼠和HCN1通道基因敲除的C57BL/6J小鼠各48只(雌雄各半)分别记为正常组和敲基因组,反转录PCR(RT-PCR)、荧光定量PCR (Q-PCR)、Western blot和免疫荧光双标检测其膀胱ICCs中BK通道各亚基的表达变化,离体逼尿肌肌条实验检测加入BK通道阻滞剂IBTX前后肌条收缩的变化,激光共聚焦显微镜下检测分别加入BK通道激动剂NS1619、阻滞剂IBTX前后小鼠膀胱ICCs内钙荧光的变化.结果 Q-PCR显示敲基因组小鼠膀胱中BK通道α、β1、β2、β3、β4各亚基表达均降低(P＜0.01);Western blot显示敲基因组小鼠膀胱中BK通道α、β1、β2、β3、p4亚基表达均降低(其中α、β3、β4:P ＜0.01;β1、β2:P＜0.05);免疫荧光双标显示敲基因组小鼠膀胱ICCs中BK通道α亚基表达降低(P＜0.01);离体逼尿肌肌条实验显示加入IBTX后敲基因组和正常组肌条收缩幅度均变大(P＜0.01,P＜0.05),且敲基因组肌条收缩幅度的变化值小于正常组(P＜0.05);激光共聚焦显微镜下可见加入NS1619后两组ICCs内钙荧光均降低(P＜0.05)、加入IBTX后两组ICCs内钙荧光均增强(P＜0.01),且不论加入激动剂或阻滞剂,敲基因组加药前后ICCs内钙荧光的变化值均小于正常组(P＜0.01).结论 小鼠HCN1通道基因敲除下调了其膀胱ICCs中BK通道的表达及功能,这种下调可能是对HCN1通道基因敲除后膀胱收缩减弱的一种代偿.
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决奈达隆对新生大鼠心室肌细胞HCN通道mRNA和蛋白表达的影响
目的 通过检测新生大鼠心室肌细胞在给予药物决奈达隆前后超极化激活环核苷酸门控阳离子通道(HCN通道)mRNA和蛋白水平的变化,探讨决奈达隆对HCN通道表达的影响.方法 分离新生SD大鼠心室肌,Ⅱ型胶原酶消化,通过差速贴壁分离法收集获得单一的心室肌细胞.并根据浓度(0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0μmol/L的决奈达隆对细胞进行处理48h)和时间(浓度为10 μmol/L的决奈达隆对细胞进行1、6、12、24、48 h的处理)梯度分组.采用实时荧光定量PCR法和Western blot检测HCN2、HCN4通道mRNA水平和蛋白水平.结果 浓度梯度组和时间梯度组的HCN2 mRNA和HCN4 mRNA表达水平均低于对照组(P＜0.05);与对照组比较,10 μmol/L决奈达隆处理后12 h组的蛋白水平明显下调(P＜0.01).结论 决奈达隆可抑制HCN2、HCN4通道mRNA和蛋白的表达,且作用呈浓度依赖性,在给药后12 h达到大作用.
关键词： 决奈达隆 超极化激活环核苷酸门控阳离子通道 RNA 信使 蛋白质类 -
超极化激活环核苷酸门控阳离子通道的研究现状
0 引言 超极化激活环核苷酸门控的超极化阳离子通道(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation chan-nel,HCN)的研究起源于Ih的发现,Noma和Irisawa已经在研究窦房结起搏活动时发现这一离子流并命名为Ih(hyperpolar-ization-activated current),20世纪80年代初Di Francesco和Irisawa等
关键词： 超极化激活环核苷酸门控阳离子通道 起搏 电流 -
小鼠纹状体HCN通道的表达
目的 观察C57BL/6小鼠纹状体超极化激活环核苷酸门控阳离子(HCN)通道1～4亚型的表达情况.方法 正常小鼠心脏灌注后取脑,制备冷冻纹状体冠状切片,应用免疫组织化学方法观察HCN通道4种亚型的表达情况及分布.结果 HCN通道4种亚型在纹状体神经元中都有表达,且主要表达在神经元细胞膜上.细胞计数结果显示,纹状体HCN通道1～4亚型阳性细胞平均数比较差异均有显著性(F=540.48,q=16.30～53.54,P＜0.05).结论 C57BL/6小鼠纹状体神经元有HCN通道1～4亚型表达.HCN通道1、2亚型表达较多,HCN通道3亚型表达较少,而HCN通道4亚型表达少.
关键词： 超极化激活环核苷酸门控阳离子通道 纹状体 免疫组织化学 小鼠 近交C57BL
