首页 > 文献资料
-
视网膜发育中的神经干细胞
视网膜作为脑组织的延伸,存在大量神经干细胞,在内外源性因子机制及各基因调节机制作用下,增殖分化为视网膜各型神经元及神经胶质细胞.应用无血清培养及单细胞克隆技术可分离培养出特异性表达nentin的视网膜干细胞.由于视网膜干细胞具备自我更新能力及多分化潜能,有望用于退行性神经疾病如:视网膜色素变性、老年黄斑变性、晚期青光眼等的细胞替代治疗或药物、基因治疗的载体.
-
胎牛血清传代培养诱导新生大鼠视网膜干细胞向视网膜神经节样细胞分化的研究
目的：探讨胎牛血清（ FBS）传代培养诱导新生大鼠视网膜干细胞向视网膜神经节细胞（ RGCs）分化的可能性，为视网膜细胞体外诱导研究提供新思路和新方法。方法本研究采用新生5d的大鼠作为实验动物，来源于北京维通利华实验动物技术公司。采用贴壁培养法分离小鼠视网膜细胞的胰蛋白酶，在10％FBS的DMEM／F12培养基中传代培养，经过连续传代纯化细胞。通过免疫荧光法和逆转录-聚合酶链式反应（ RT-PCR）鉴定诱导细胞的分化情况。结果大鼠视网膜混合细胞原代培养24 h后，可见部分细胞开始贴壁、伸展，但仍有大量细胞悬浮。48 h换液时，可见大量细胞呈短梭形，分散贴壁生长。4 d后可见细胞呈集落样生长，具有典型的RSCs形态；7～10 d后细胞融合成片，可传代。传代后12 h内细胞贴壁，多呈长扁形，双极性，末端呈分枝状。传至第3代时，细胞生长旺盛；传至第5代时，细胞生长减缓，形态趋于一致。免疫荧光鉴定表达蛋白的结果：（1）原代混合细胞：表达光感受器标志物及干细胞标志物Nestin，节细胞标志物Thy-1，视紫红质及Muller胶质细胞标志物谷氨酰氨合成酶。从荧光强度和数量可以看出，与本身细胞核染色密度相比，光感受细胞、节细胞和Muller胶质细胞的数量并不多，且存在大量表达阳性Nestin的RSCs；（2）高血清培养体系纯化的第5代细胞：细胞形态未发生改变，表达视网膜神经节细胞的标志物Thy-1、Nogo-R及Tuj1，均呈强阳性。 RNA的含量为0．287μg／ml，RNA纯度为1．66。电泳结果：（1）第1代F1细胞PCR的结果：RPCs的标志物Nestin及Masushi为阳性，证明存在一定数量的RSCs。而成熟节细胞的标志物Thy-1为弱阳性，证明成熟RGCs细胞的含量不高。阳性对照的Actin为强阳性。（2）第5代F5细胞PCR的结果：RPCs的标志物Nestin及Masushi为弱阳性，证明残留的RSCs数量较低。而成熟节细胞的标志物Thy-1为强阳性，证明产生了大量的类节细胞。阳性对照的Actin为强阳性。大鼠视网膜混合细胞存在发育成熟的光感受器细胞、神经节细胞及胶质细胞，但细胞数量并不多，且存在一定数量的RSCs。经高血清贴壁诱导后，RSCs可分化为大量具有RGCs标志物的细胞。结论在体外分离的SD大鼠视网膜混合细胞中存在RSCs。通过FBS体系的传代诱导，可得到具有RGCs表型的细胞。
-
干细胞与组织工程学在眼科中的应用前景
一、干细胞与组织工程学的基本概念干细胞是指具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的一类未分化细胞,主要分为两大类:一类是胚胎组织来源,可以分化为3个胚层的各种细胞,如胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC);另一类是源于成体组织,能够产生所在特定组织的各种细胞,称为成体干细胞,如骨髓间质干细胞(bone marrow stromal stem cell,BMSC)、神经干细胞(neural stem cell,NSC)、视网膜干细胞以及角膜缘干细胞等.
-
大鼠视网膜干细胞的增殖和多向分化
背景:国内对视网膜干细胞的体外分离培养及鉴定仍处于初步探索阶段.目的:体外分离、培养及鉴定新生大鼠视网膜干细胞,探讨其多向分化潜能.方法:用神经干细胞无血清培养方法分离和培养新生24 h的SD大鼠睫状体细胞,第6代视网膜干细胞经胎牛血清诱导分化,应用免疫细胞化学方法检测视网膜干细胞的分化特性.结果与结论:体外培养的细胞球具有连续克隆能力,Nestin抗原阳性,BrdU 标记结果显示悬浮细胞团主要由分裂增殖的细胞组成,并表达胚胎发育早期视网膜内原始细胞的特异性抗原Chx-10;诱导分化后的细胞表达星形胶质细胞特异性标志物GFAP、神经元特异性标志物NSE、感光细胞标志物Opsin、双极细胞特异性抗原PKC和节细胞特异性抗原β-tubulin,实验初步证实培养的视网膜干细胞具有神经干细胞特性,能自我更新和增殖分化成为感光细胞类型的细胞.
-
干细胞移植治疗视网膜色素变性研究进展
视网膜色素变性(RP)是一组遗传性退行性视网膜疾病,主要影响视杆细胞和视网膜色素上皮细胞(RPE).
-
视网膜神经节细胞无血清上清培养液诱导大鼠视网膜干细胞的分化
目的 探讨视网膜神经节细胞无血清上清培养液对视网膜干细胞分化的影响.方法 分离大鼠视网膜干细胞和视网膜神经节细胞;采用免疫荧光法鉴定体外培养的大鼠视网膜干细胞与视网膜神经节细胞,视网膜干细胞以Nestin抗体进行鉴定,视网膜神经节细胞以Thy-1抗体进行鉴定;以视网膜神经节细胞无血清上清培养液培养视网膜干细胞,以不加入条件培养液培养的视网膜干细胞为对照组,收集分化细胞,采用qPCR法检测Nestin、Pax6、Thy-1及Brn-3的基因表达.结果 培养的视网膜干细胞Nestin抗体染色阳性,视网膜神经节细胞Thy-1抗体染色阳性.培养视网膜干细胞72 h后,与对照组相比,无血清上清培养液组细胞Nestin和PAX6基因相对表达量降低,差异均有统计学意义(均为P＜0.000 1);Thy-1和Brn-3基因相对表达量升高,差异均有统计学意义(均为P＜0.05).结论 视网膜神经节细胞无血清上清培养液能够诱导视网膜干细胞分化为视网膜神经节样细胞.
-
睫状缘色素细胞与骨髓间充质干细胞体外共培养构建视网膜干细胞的初步研究
目的 探索睫状缘色素细胞(pigmented cells from the ciliary margin,PCM)与骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BM)体外共培养构建视网膜干细胞的可行性.方法 按照组织贴壁培养方法分别分离培养原代大鼠BM和PCM,再将二者进行直接共培养(1∶2),观察细胞生长情况;MTT方法进行增殖能力检测;在促神经分化诱导液中诱导21 d后行免疫荧光染色,观察视网膜干细胞相关分子标记物包括视杆细胞Rho1 D4、双极神经元CHX10和Müller胶质细胞10E4的表达.结果原代分离培养的两种细胞生长状态良好;共培养后细胞总体的增殖活性虽然显著低于单纯BM,但比单纯PCM有了一定提升;诱导分化后单纯PCM视网膜干细胞相关分子标记物表达阳性率显著高于BM,而共培养后的细胞表达阳性率显著高于单纯PCM和BM.结论 采用BM与PCM共培养能够获得大量表达视网膜干细胞相关分子标记物的细胞群,有望成为视网膜干细胞来源,用于视神经损伤修复.
-
大鼠胚胎视网膜干细胞的分离培养
目的 分离培养大鼠胚胎视网膜干细胞.方法 从胎龄第16 d的SD大鼠视网膜神经上皮分离视网膜细胞并进行悬浮培养,观察细胞增殖以及自发分化情况,采用免疫细胞化学方法检测Nestin、β-Tubulin、GFAP和Recoverin的表达.结果 原代细胞可形成悬浮生长的神经球,传代后能形成新的细胞球.原代及传代细胞大部分表达神经干细胞标记物Nestin,分化后的细胞部分表达神经元标记物β-Tubulin或神经胶质细胞标记物GFAP,少数细胞表达光感受器细胞标记物Recoverin.结论 分离培养的SD胚鼠视网膜神经干细胞可以在体外扩增并具有多分化潜能.
-
干细胞移植治疗视网膜变性疾病的研究进展
视网膜变性疾病是一类与遗传相关的变性疾病,导致患者渐进性视觉丢失,是主要的致盲性眼病之一,其共同病理基础是视网膜光感受器细胞的变性、坏死和凋亡,然而目前尚无有效的治疗方法.细胞移植治疗是目前实验研究治疗视网膜变性疾病的主要方法之一.近年研究表明将感光前体细胞或视网膜色素上皮细胞移植到视网膜下腔或玻璃体内,可以延缓宿主感光细胞的凋亡、替代凋亡的感光细胞、挽救残存的视觉功能和修复视网膜结构.细胞移植治疗的一个很重要的问题是移植细胞的来源问题,目前主要的移植细胞来源是视网膜祖/干细胞、胚胎干细胞和诱导多潜能干细胞等.本文就干细胞移植治疗视网膜变性疾病的研究进展进行综述.
-
胚胎和生后大鼠视网膜干细胞在体内和体外的分化差异
目的 研究胚胎和生后大鼠视网膜干细胞(RPCs)在体内和体外的分化.方法 取胚胎18 d和生后2周SD大鼠视网膜,分别用悬浮法及贴壁法培养.传至第1代后转入分别含10 ng/ml睫状神经营养因子(CNTF)、20 ng/ml表皮生长因子(EGF)、10 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、10%视黄酸、10%胎牛血清的DMEM:F12中进行诱导分化,贴壁后2、3、5、6 d的细胞及胚胎18 d,生后1、3、5、7、14 d的大鼠视网膜切片分别行nestin、vimentin、opsin及GFAP的二步法免疫组织化学染色.结果 大鼠的RPCs在悬浮时呈球状生长,nestin染色阳性,悬浮培养传至第1代,贴壁培养传至第5代.CNTF、bFGF、EGF及视黄酸组在培养至6 d时可呈神经元样细胞改变,有轴突,但持续出现nestin阳性.生后2周的RPCs无法诱导成opsin阳性细胞.结论 RPCs可在体外培养并传代,其在分化过程中形态学的改变先于功能学变化.光感受器细胞的体外诱导较困难.
-
大鼠视网膜干细胞体外培养、增殖及分化
目的:大鼠视网膜干细胞的培养及鉴定.方法:用神经干细胞无血清培养方法从出生10 d的大鼠睫状体部分离出具有单细胞克隆能力的细胞球,用MTT法检测单克隆细胞增殖能力,应用免疫组织化学的方法检测干细胞分化特性.结果:所获得的细胞球具有连续克隆的能力,nestin抗原阳性,分化后的细胞表达星形胶质细胞、神经元、感光细胞和双极细胞特异性抗原.结论:成功培养出大鼠视网膜干细胞.
-
视网膜干细胞体外诱导分化为神经节细胞的初步研究
目的 探讨诱导视网膜干细胞(retinal stem cell,RSC)分化为视网膜神经节细胞(retinal ganglion cell,RGC)的体外培养方法,提供视神经损伤后细胞移植治疗所需的种子细胞.方法 悬浮培养胎龄14dLE大鼠来源的RSC,传2代流式细胞仪和免疫荧光鉴定后,用5％血清、BDNF、DAPT、DAPT联合BDNF4组不同方式诱导14 d.流式细胞仪行成熟RGC特异性标志物thy1.1鉴定,并对DAPT联合BDNF组不同诱导时间点行RGC相关标志物math5、brn3b、thy1.1和神经干细胞标志物nestin、ki67表达的鉴定.结果 传2代的RSCs nestin、chx10、ki67表达强阳性,部分细胞math5表达阳性;5％血清、BDNF、DAPT、DAPT联合BDNF组诱导RSCs 14 d后thy1.1阳性率分别为(11.38 ±1.58)％、(19.10±2.29)％、(23.90±1.09)％、(31.31 ±2.98)％,两两比较差异均有统计学意义(P＜0.05).DAPT联合BDNF组诱导3～5d后部分细胞nestin、ki67、brn3b、math5均阳性表达.结论 使用DAPT联合BDNF诱导,可以提高RSCs在体外分化成RGCs的比率,并且诱导3～5d后,RGCs相关标志物出现,细胞仍具有一定增殖能力.
-
RCS大鼠自然病程中视网膜边缘生发区细胞增殖及Shh/Ptc信号途径改变的观察
目的 观察遗传性视网膜色素变性RCS大鼠病程发展中视网膜边缘生发区Shh/Ptc信号途径改变及其与该区细胞增殖能力变化的关系.方法 RCS大鼠按出生后病程变化分为15、30、60、90 d 4组(免疫组化每组4只,PCR每组3只),以同龄含色素的正常大鼠(Long-Evan's 大鼠)作为正常对照.视网膜组织切片DAPI荧光染色观察外核层(outer nuclear layer,ONL)厚度的变化;视网膜细胞增殖标记Ki67免疫荧光染色观察视网膜边缘生发区细胞增殖能力的变化;荧光定量PCR检测视网膜边缘生发区Shh/Ptc信号途径中关键分子Shh、Ptc1、Smo和Gli1 mRNA表达水平.结果 ①RCS大鼠从第15天开始,随着年龄的增加视网膜ONL逐渐变薄,第90天ONL几乎消失.②正常对照组大鼠视网膜边缘生发区Ki67阳性细胞较少,与同龄正常对照组大鼠相比,出生30、60 d组大鼠Ki67阳性细胞数均显著增多(P＜0.05);大鼠各年龄组间比较,60 d组Ki67阳性细胞数明显增多(P＜0.01).③60 d组大鼠视网膜边缘生发区Shh、Ptc1、Smo和Gli1mRNA表达水平明显上调.结论 出生后60 d RCS大鼠视网膜边缘生发区Shh/Ptc信号途径的激活,可能刺激了该部位细胞短期的增殖.
关键词： 视网膜色素变性 视网膜干细胞 细胞增殖 Shh/Ptc信号途径 荧光定量PCR -
视网膜神经干细胞研究进展
视网膜是一层对光敏感的、精细的膜样结构，是形成各种视功能的基础。由胚胎时期神经外胚叶形成的视杯发育而来，视杯外层形成单一的视网膜色素上皮层，视杯内层则分化为视网膜神经感觉层。视网膜神经感觉层由外向内分别是：视锥、视杆层，外界膜，外核层，外丛状层，内核层，内丛状层，神经节细胞层，神经纤维层，内界膜（属 Müller 细胞的基底膜）。视网膜是由各种分子组成和神经化学物质不同的细胞类型组成的复杂的网络结构。这些不同成分组成的高度活性的神经元和神经胶质以相当精确的组织层分层，经常呈有秩序分布，周围包绕丰富的、分层的细胞外基质及二元脉管系统［1］。所有的视网膜组成成分均影响视网膜祖细胞的增殖和生存，它们通过紧密有秩序的基因和微环境机制完成。哺乳动物的视网膜起源于神经外胚层来源的视网膜祖细胞，早发生于视神经管两侧突出视泡。视网膜祖细胞重复增殖，子细胞终退出细胞细胞周期，分化成数十种类型，形成有规则的镶嵌式物质散布于细胞体的交互层和突触连接。
-
bHLH转录因子对视网膜细胞命运决定的作用
在视网膜发育过程中,bHLH转录因子起到了相当重要的作用.抑制型bHLH转录因子促进视网膜干细胞状态的维持和出生后视网膜胶质细胞的分化.而活化型bHLH转录因子的激活则促进神经元细胞的分化.另外,同源结构域转录因子也参与到这一过程.本文将对这些方面作一综述.
-
组织干细胞模型的研究进展
目前,已经从许多组织或器官中成功地分离出干细胞,其中包括:ES、造血干细胞、骨髓间充质干细胞(MSC)等.此外,还有近来研究渐多的神经干细胞(NSC)、肌肉干细胞、成骨干细胞、内胚层干细胞及视网膜干细胞等.
-
凋亡诱导因子(AIF)和caspase-12在视网膜病变中的作用
视网膜炎色点作为神经病变疾病中的一种,其细胞凋亡的分子机制尚未研究清楚.笔者讨论了来自线粒体与来自内质网的两种细胞凋亡途径在rd1模型大鼠视网膜色点发生的病变过程中共同作用.在体内以及体外细胞模型中,AIF和caspase-12都转移到死亡的光感受器细胞的细胞核上,并且这两种凋亡因子的转移都受到胞内钙离子动态平衡以及钙蛋白酶的活性改变的影响.基因表达下调等试验证明了AIF在该凋亡过程中起主要作用,而caspase-12起到加强的效果,从而说明了在发生病变的神经元中的线粒体和内质网中两个caspase依赖性的凋亡途径之间的关系.对这些问题的进一步研究有助于对细胞凋亡分子机制的深入认识并促进该疾病治疗研究的发展.
