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鼻咽癌的RUNX3基因甲基化改变对指导适量放疗的意义
目的:本文探讨了鼻咽癌发生发展过程中RUNX3基因甲基化改变的分子机制假说,为鼻咽癌分子病理诊断及个体化的诊断和治疗手段奠定一定的基础.
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亚砷酸钠致早期鸡胚胚胎发育毒性与基因甲基化的关系
目的:研究亚砷酸钠致鸡胚胚胎毒性与基因组DNA整体甲基化的关系以及补充甲基供体胆碱对无机砷致胚胎毒性的影响.方法:以鸡胚为模式动物检测亚砷酸钠及其与胆碱联合处理对鸡胚生存能力、体重及形态的影响;采用whole-mount免疫荧光技术检测鸡胚基因组DNA整体甲基化水平;应用荧光定量PCR技术,研究受甲基化调节的bcl2、c-myc、cdkn2a,calb2基因在不同处理组鸡胚中的表达模式.结果:砷处理组鸡胚存活率下降(P<0.01),体重降低(P<0.01),并诱导鸡胚发育畸形,基因组DNA整体甲基化水平降低(P<0.01),受甲基化调节的基因bcl2(P<0.05)、c-myc(P<0.01)表达下调;补充甲基供体胆碱,未明显恢复鸡胚的生存力和改变鸡胚发育异常,对鸡胚基因组DNA整体甲基化水平亦无明显影响,但c-myc(P<0.01)、cdkn2a(P<0.01)、calb2(P<0.05)基因的表达均显著下降.结论:亚砷酸钠能够诱导鸡胚发育异常,其作用可能是通过降低基因组DNA整体甲基化水平实现.补充甲基供体胆碱不能拮抗其致畸效应.
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针刺印堂百会风池肾俞穴组对慢性应激模型大鼠海马脑源性神经营养因子基因表达的影响
目的 探讨针刺印堂百会风池肾俞穴组治疗抑郁症的可能作用机制.方法 40只SD大鼠随机分为正常组、模型组、针刺组、西药组,每组10只.正常组大鼠正常饲养,其余各组大鼠孤养并进行28天的不可预见的慢性应激刺激建立慢性应激性大鼠模型.造模同时模型组每日予2 ml生理盐水灌胃;针刺组选用印堂、百会、风池(双侧)、肾俞(双侧)进行针刺治疗,每次30 min,每日1次;西药组给予氟西汀胶囊0.18 mg/(kg·d)灌胃,每日1次,各组均灌胃28天;正常组正常饲养不灌胃.检测各组大鼠海马脑源性神经营养因子(BDNF)、环磷腺苷效应元件结合蛋白(CREB) mRNA含量及海马BDNF I-17位点、BDNFI-17 CpG6位点基因甲基化水平.结果 与正常组比较,模型组大鼠海马CREB、BDNF mRNA含量水平明显降低(P＜0.05或P＜0.01);针刺组和西药组较模型组大鼠海马CREB、BDNF mRNA含量增加(P＜0.05).各组大鼠BDNFI-17位点甲基化水平未出现明显差异(P＞0.05),在BDNF I-17 CpG6位点上模型组大鼠甲基化水平明显低于正常组(P＜0.05),其他各组未出现明显差异.结论 针刺印堂百会风池肾俞穴组可有效增加慢性应激模型大鼠海马内CREB、BDNF mRNA水平,可能是其抗抑郁机制之一.
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左归丸对骨髓间充质干细胞成骨分化相关基因甲基化的影响
目的 研究左归丸对骨髓间充质干细胞(BMSCs)向成骨分化的表观遗传学机制.方法 30只SD大鼠给予左归丸溶液(浓度为472.5 g/L)灌胃,每次1ml,每日2次,连续灌胃3天后经腹主动脉采血,制备左归丸含药血清.无菌条件下取出SD大鼠双侧股骨和胫骨,收集骨髓冲洗液,贴壁法培养传代所得BMSCs.取2代BMSCs以5×104/cm2密度接种于培养皿,分为3组,对照组常规培养;成骨诱导组用10％空白血清加成骨诱导剂培养;左归丸组用10％左归丸含药血清加成骨诱导剂培养.干预14天后采用RT-PCR及甲基化特异性PCR检测法进行Runx2、Osterix、OC及β-catenin基因表达和甲基化状态检测. 结果 左归丸组Runx2、Osterix、OC、β-catenin的相对表达量较对照组、成骨诱导组均上调(P＜0.05).左归丸组Runx2、Osterix、OC、β-catenin基因甲基化率均低于对照组、成骨诱导组(P＜0.05). 结论 左归丸含药血清可通过去甲基化的表观遗传调控机制促进BMSCs向成骨细胞分化.
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CEBPA基因突变和表达异常在急性髓系白血病中的作用研究
CCAAT增强子结合蛋白A(CEBPA)基因及其编码的转录因子CCAAT增强子结合蛋白α(C/EBPα)通过促进造血干/祖细胞向粒系分化并抑制细胞增殖,在造血系统早期分化过程中起重要作用.CEBPA基因的突变及其在转录、翻译及翻译后水平受到的异常调控可引起C/EBPα蛋白结构或表达异常,导致粒系分化成熟障碍、不成熟粒系前体细胞异常增殖,是急性髓性白血病(AML)的重要发病机制.CEBPA基因突变和表达异常调节对AML患者的预后有重要影响,并可作为诱导分化治疗的靶点.本文就CEBPA基因突变与AML、C/EBPα蛋白表达调控异常与AML及C/EBPα蛋白与靶向治疗进行综述.
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急性髓系白血病中DKK-3和WIF-1甲基化状态和mRNA表达的研究
目的:研究DKK-3和WIF-1在急性髓系白血病(AML)患者中的启动子甲基化状态和mRNA表达情况及其临床意义.方法:用甲基化特异性聚合酶链式反应(MSP)检测56例AML患者骨髓标本和20例缺铁性贫血患者(对照组)骨髓标本中DKK-3和WIF-1启动子甲基化状态;用实时定量PCR检测上述标本中β-catenin、DKK-3和WIF-1mRNA表达情况,并分析其与临床资料及生存时间的关系.结果:AML组中DKK-3和WIF-1启动子甲基化率明显高于对照组(x2=15.330,P＜0.001;x2 =17.371,P＜0.001),且与性别、年龄、临床分型无相关性.DKK-3和WIF-1 mRNA相对表达量在AML患者中依次为0.840±0.320和0.792±0.313,明显低于对照组的1.134±0.392和1.047±0.334(t=3.415,P=0.000;t=3.070,P=0.003).AML患者骨髓标本3-catenin的mRNA相对表达量为0.756±0.304,高于对照组骨髓标本表达量0.342±0.105(t =5.943,P=0.001),且AML骨髓标本中DKK-3和WIF-1 mRNA相对表达量和β-catenin相对表达量呈均呈负相关性(r=-0.543;r=-0.562).Kaplan-Meier生存曲线分析显示,DKK-3甲基化阳性组AML患者总体生存时间短于阴性组患者(x2=3.957,P=0.042),而WIF-1甲基化阳性组AML患者总体生存时间亦短于阴性组患者(x2=4.520,P=0.029).结论:AML患者中Wnt/β-catenin信号通路存在有异常激活,DKK-3和WIF-1启动子甲基化可能参与了Wnt通路激活及AML的发病过程并影响其总体预后.
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重亚硫酸氢盐测序法检测Wnt信号通路抑制基因在急性早幼粒细胞白血病细胞中甲基化变化
目的:应用重亚硫酸氢盐测序法(bisulfite sequencing PCR,BSP)检测急性早幼粒细胞白血病细胞株(NB4) Wnt信号通路抑制基因启动子区CPG岛的甲基化状态,筛选NB4细胞中高甲基化的Wnt信号通路抑制基因,并探讨BSP法作为定量研究基因甲基化方法的优缺点.方法:以NB4细胞为研究对象,20例健康人单个核细胞为对照;常规提取DNA并用亚硫酸氢盐处理,然后用PCR扩增目标序列,应用重亚硫酸氢盐测序法(BSP)分析在NB4细胞中Wnt信号通路抑制基因基因的甲基化状态.并通过与甲基化特异性PCR (methylation specific PCR,MSP)、焦磷酸测序技术(pyrosequencing)比较、评价BSP法检测NB4细胞Wnt信号通路抑制基因甲基化状态的优缺点.结果:BSP产物克隆测序检测NB4细胞Wnt信号通路抑制基因甲基化发生率分别为:WIF-1基因95.26％,DKK3基因86％,SFRP1基因81.67％,SFRP2基因95.71％,SFRP4基因85％,SFRP5基因95％;20例健康人单个核细胞为对照组中Wnt信号通路抑制基因甲基化发生率分别为:WIF-1基因1.5％,DKK3基因4.2％,SFRP1基因0％,SFRP2基因0.9％,SFRP4基因2.5％,SFRP5基因1.75％.与正常人MNC相比,NB4细胞的Wnt信号通路相关抑制基因启动子甲基化率明显增高.结论:急性早幼粒细胞株NB4细胞中存在Wnt信号通路多个抑制基因高甲基化状态.此类基因异常甲基化有可能成为急性早幼粒细胞白血病的早期诊断指标和治疗靶点.
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Id4基因启动子甲基化在髓系白血病完全缓解期监测中的意义
本研究探讨id4基因甲基化在完全缓解急性髓系白血病(AML)病情监测中的意义.采用甲基化特异性PCR(MS.PCR)对经诱导缓解和巩固强化4-5疗程后持续完全缓解的AML患者进行id4基因启动子区甲基化状况分析,并随访.结果表明:id4基因在32例AML中有15例id4基因甲基化,其中7例在随访期间出现复发或复发倾向.17例id4基因非甲基化的患者在随访期间完全缓解.结论:在完全缓解的AML患者中进行id4基因启动子区甲基化检测可在一定程度上预测白血病的复发.
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ABO基因启动子CpG岛甲基化与白血病的相关性
近年来研究发现ABO血型与许多疾病的发生发展相关,某些肿瘤导致A、B血型物质减少的现象已日益引起关注.本研究探讨ABO基因启动子CpG岛甲基化与白血病的相关性.采用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测了不同血型的健康人群和各种血液病患者外周血红细胞表面ABH抗原的相对含量,用PCR和MSP-PCR分别检测血液病患者和健康人ABO基因启动子DNA序列和CpG岛甲基化,以及ABO基因启动子-102位点的甲基化.结果发现,白血病患者均出现不同程度的A、B抗原减少;通过对比检测健康人和患者的AB0基因启动子序列,未发现有序列的不同,说明启动子序列高度保守;利用重亚硫酸盐对DNA样本进行修饰后,通过对健康人和患者的ABO基因启动子序列进行扩增和测序,发现健康人和再生障碍性贫血患者在ABO基因启动子的CpG岛区没有甲基化的位点,而急性髓性白血病(AML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性粒细胞白血病(CML)和部分骨髓增生异常综合征(MDS)患者在位置为-102、-101、-100、-99和-97位置的C碱基均有甲基化的现象.结论:甲基化是造成白血病患者AB抗原下降的原因;-102、-101、-100、-99和-97这几个甲基化位点有可能是白血病的特异性表现;针对-102位点检测结果提示-102位点是否甲基化有可能作为白血病鉴别诊断中一个有意义的分子标识物.
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巢式MSP法检测急性白血病患者P16基因甲基化状态
为了研究p16基因甲基化和缺失与急性白血病发病的关系,探讨其在成人急性白血病发生发展中的生物学意义,应用巢式甲基化特异性聚合酶链反应(nested methylation specific polymerase chain reaction,n-MSP)分析了82例各种亚型的急性白血病患者在初诊或复发不同阶段p16基因的甲基化和缺失状态,并且在基因组硫化修饰PCR后克隆测序验证结果的准确性.结果表明:82例急性白血病(AL)患者p16基因甲基化的出现率为39.0%,其中急性髓系白血病(AML)患者为41.4%,24例急性淋巴细胞白血病(ALL)患者为33.3%;初治AL患者为36.6%,而复发患者则为54.5%.82例AL患者中有6例p16基因缺失,缺失率为7.3%,在AML、ALL患者中分别为1.7%和20.8%.16例健康自愿者或非恶性血液病患者p16基因则未发生甲基化或缺失.结论:在成人急性白血病的发生发展中,p16基因甲基化比p16基因纯合缺失更具有意义;p16基因表达异常与成人急性白血病的发生发展密切相关.
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runx3启动子区域甲基化在急性白血病中意义的初步研究
为了探讨runx3基因启动子区域甲基化在急性白血病发病机制中的作用及其临床意义,采用甲基化特异性PCR(MS-PCR)检测CHRF、U937、K562细胞系及40例急性白血病患者和10例正常人骨髓或外周血runx3基因启动子区域的甲基化情况,并用RT-PCR方法检测各系runx3基因的表达情况.结果发现,健康人及细胞系中均未检测到甲基化,而检测到该基因的表达;40例急性白血病患者甲基化检测阳性率35%(14/40),明显高于正常人0%,差异有统计学意义(p<0.05),其中AML 30.43%(7/23),ALL 41.18%(7/17),P>0.25,两者无明显差异.甲基化检测阳性患者均未检测到runx3基因的表达.存在runx3启动子区域甲基化患者化疗前骨髓原始细胞数均高于runx3启动子区域未甲基化患者(p<0.01),而且首次化疗后完全缓解率低于未甲基化者(p<0.05),差异有显著性.结论:runx3基因启动子区域甲基化在急性白血病的发病机制中起一定的作用,其检测对估计白血病预后具有临床意义.
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急性白血病Id4基因启动子区甲基化状态研究
本研究探讨正常人和不同疾病状态急性白血病(AL)患者Id4基因启动子区甲基化状态差异.采用甲基化特异性聚合酶链反应(MS-PCR)对正常人和AL患者骨髓进行Id4基因启动子区甲基化状况检测.结果表明:Id4基因在正常骨髓中呈完全性非甲基化状态,初治AML和ALL患者中Id4基因甲基化比例分别为84%和86%.8例复发难治的AL患者中Id4基因全部甲基化,14例Id4基因甲基化的完全缓解ALL患者中有8例在12个月内复发,而9例Id4基因非甲基化的完全缓解ALL患者中12月内复发仅1例;Id4基因呈甲基化状态的完全缓解的AML患者中12个月内复发率为62.5%,而在非甲基化的患者中12个月内复发率仅为10%,两者差异有显著性意义.完全缓解的ALL患者甲基化比例为64.3%,而完全缓解的AML患者甲基化比例为28.6%,两者差异有显著性意义.39例初治AL中,有33例Id4基因呈甲基化状态,8例复发难治的AL患者的Id4基因均呈甲基化状态,58例完全缓解的AL中,有24例Id4基因呈甲基化状态.结论:与正常人不同,AL患者中Id4基因都发生了不同程度的甲基化改变,缓解状态患者的甲基化比例低于非缓解状态患者,Id4基因甲基化模式的改变与AL的发生密切相关.
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DNA抑制因子4作为急性淋巴细胞白血病临床复发前报告因子的可行性初探
本研究探讨以DNA抑制因子4作为急性淋巴细胞白血病(ALL)复发前报告因子的可行性.以骨髓持续完全缓解6-8个月的ALL患者为研究对象,应用甲基化特异性聚合酶链反应(MS-PCR)对经诱导缓解和巩固强化后持续完全缓解的32例ALL患者进行DNA抑制因子4启动子区甲基化状况分析,并随诊3个月以上.结果发现,32例完全缓解的ALL患者中20例(62.5%)DNA抑制因子4呈甲基化.12例DNA抑制因子4呈非甲基化的患者中只有1例3个月内复发,复发率8.33%,20例DNA抑制因子4呈甲基化状态的患者中10例3个月内复发,复发率50%.DNA抑制因子4甲基化与ALL患者初诊时是否具有高危因素并不完全相关.结论:DNA抑制因子4可作为ALL患者临床复发前的报告因子.
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在不同类型骨髓增生异常综合征Id4基因甲基化差异的初步研究
本研究探讨Id4基因在不同类型骨髓增生异常综合症(MDS)患者中的甲基化情况差异.采用甲基化特异性聚合酶链反应(MS-PCR)对50例不同类型MDS患者骨髓进行Id4基因启动子区甲基化状况检测,并以缺铁性贫血患者骨髓作为对照.结果发现:Id4基因在对照组骨髓中呈完全非甲基化状态,在MDS各种类型中,甲基化状态有差异:6例RA、2例RARS和4例MDS-U患者骨髓Id4基因均呈非甲基化状态,而18例RCMD中有2例,12例RAEB Ⅰ和8例RAEBⅡ中各有3例为Id4基因甲基化.骨髓原始细胞比例分别低于和高于5%的两组患者中,Id4甲基化分别有2例和6例,各占每组的6.7%和30%,差异有显著性意义.初步结论是:骨髓原始细胞比例高的MDS患者有可能发现Id4基因甲基化.
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骨髓增生异常综合征患者ZO-1基因甲基化状态检测的临床意义
本研究探讨紧密连接蛋白(zonula occludens-1,ZO-1)基因异常甲基化在骨髓增生异常综合征(MDS)诊断中基因标志作用的临床意义.采用甲基化特异性-PCR(MS-PCR)方法分析30例健康人骨髓标本及85例MDS患者骨髓标本的ZO-1基因启动子区甲基化状况.结果显示:ZO-1基因在30例健康人标本中均呈完全非甲基化状态;MDS患者骨髓中ZO-1基因甲基化阳性率(56.5%)明显高于健康人,二者差异有统计学意义(P＜0.05).MDS各亚型病人骨髓ZO-1基因启动子区甲基化阳性率均高于健康人,其差异也具有统计学意义(P＜0.05).MDS亚型RA、RAS、RAEB、RCMD间ZO-1基因甲基化阳性率差别无统计学意义(p＞0.05).结论:与健康人相比,MDS病人骨髓中ZO-1基因启动子区呈高甲基化状态并具有特异性.MDS是一种常见的克隆增殖性血液系统疾病,在临床诊断中有时很难与其他疾病相鉴别,而ZO-1基因甲基化模式的改变与MDS的发生密切相关,因此ZO-1基因作为有价值的诊断标志具有重要的临床意义,它可能是一个潜在的血液系统恶性疾病的相关基因.
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恶性血液病细胞株中IEX-1基因启动子区CpG岛甲基化状态的初探
本研究探讨基因IEX-1启动子区CpG岛甲基化状态的改变及其与恶性血液病发生的相关性.应用MSP的方法检测9种恶性血液病细胞系中IEX-1基因启动子区CpG岛甲基化状态,并把经M.sssI酶处理过的正常人外周血单个核细胞中IEX-1 CpG岛甲基化状态作为阳性对照,把正常人外周血单个核细胞中IEX-1 CpG岛甲基化状态作为阴性对照.结果显示:在NB4、Molt4.、Raji细胞系中IEX-1基因启动子区CpG岛呈高甲基化状态;在CA46、CEM、U937、K562、HL-60、Jurkat细胞系中IEX-1基因启动子区CpG岛呈部分甲基化状态;在正常人外周血单个核细胞中IEX-1基因启动子区CpG岛呈非甲基化状态;经M.sssI酶处理过的正常人外周血单个核细胞中IEX-1基因启动子CpG岛呈高甲基化状态.结论:IEX-1基因启动子区CpG岛甲基化状态的改变与恶性血液病有一定的相关性.
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巢式MS-PCR法检测恶性血液病细胞株APC基因启动子甲基化状态
本研究旨在应用巢式甲基化特异性PCR(nMS-PCR)法检测10种恶性血液系统肿瘤细胞株APC基因启动子的甲基化状态,并探究其在肿瘤发生发展中的作用,同时筛选出APC基因启动子高甲基化的肿瘤细胞株,将其作为研究基因甲基化与表达关系的细胞模型.采用nMS-PCR扩增亚硫酸盐修饰后的10种肿瘤细胞株基因组DNA,检测其APC基因启动子区CpG岛的甲基化状态.结果表明,CA46、U266、Molt4、K562、HL-60、CEM、AKR、U937、Raji细胞的APC基因启动子区均未甲基化,而Jurkat细胞的APC基因启动子区出现甲基化.结论:用nMS-PCR可以准确地检测出恶性血液病细胞株APC基因的甲基化状态,该方法操作简便,可用于检测各种肿瘤细胞基因的甲基化状态.
关键词： 巢式甲基化特异性聚合酶链反应 恶性血液病细胞株 APC基因 基因甲基化 -
巢式MSP法检测恶性血液病细胞株p16基因启动子甲基化状态的研究
本研究应用改进的甲基化特异性PCR(MSP)法,即巢式甲基化特异性PCR法检测6种肿瘤细胞株p16基因启动子的甲基化状态效率,探讨其在筛选p16基因启动子高甲基化的肿瘤细胞株,及将其作为研究基因甲基化与表达关系的理想细胞模型中的应用.6种肿瘤细胞株基因组DNA经碱变性后以亚硫酸盐修饰,再用巢式甲基化特异性聚合酶链反应扩增,分析检测其p16启动子区CpG岛的甲基化状态.结果表明:CA46、U266都有不同程度的p16基因启动子区甲基化,而Molt4、K562、HL-60、Jurkat的p16基因启动子区均未甲基化.结论:用巢式甲基化特异性PCR可以准确的检测出恶性血液病细胞株p16基因的甲基化状态,方法简单,灵敏且重复性强,可以广泛用于筛选各种p16基因启动子区甲基化的恶性血液病细胞株以及恶性血液病诊断.
关键词： 巢式甲基化特异性聚合酶链反应 恶性血液病细胞株 p16基因 基因甲基化 -
半巢式甲基化特异性聚合酶链反应对肿瘤细胞株p15基因甲基化或缺失状态的检测
本研究分析多种恶性肿瘤细胞株的p15基因甲基化或缺失状态,阐明p15基因甲基化或缺失在肿瘤发生发展中的作用.运用半巢式甲基化特异性聚合酶链反应(hemi-nested methylation specific polymerase chain reaction,hn-MSP)分析20种恶性肿瘤细胞株和正常人单个核细胞或细胞株的p15基因甲基化及缺失状态,并评价该方法的敏感性和特异性.结果表明:在所有的细胞中,Molt-4、Raji、KG1、CA46、SW480、NCE、SMMC-7221、NCI-H446细胞为部分甲基化,hn-MSP检测p15基因甲基化敏感性可达到1×10-5.正常人单个核细胞、HL-60、HeLa、HepG2、293、SGC7901、U266、CEM细胞则为p15非甲基化,而K562、NB4、GMC、Jurkat似乎显现p15基因缺失或突变.结论:p15基因甲基化或缺失在多种肿瘤,特别在恶性血液病中有较高的发生率,且对疾病的进展及预后有密切的关系,hn-MSP具有较高的敏感性和特异性,值得在临床推广应用.
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银屑病患者骨髓CFU-HPP集落形成及集落细胞p16基因启动子甲基化的研究
本研究检测银屑病患者骨髓高增殖潜能集落形成单位(CFU-HPP)的集落形成能力及集落细胞p16基因启动子甲基化状态,并探讨两者之间的关系.收集了24例银屑病患者及正常时照者骨髓,采用密度梯度离心法分离单个核细胞,并于含SCF/GM-CSF/IL-3/IL-6细胞因子组合的甲基纤维素半固体培养液中,培养14天计数CFU-HPP集落,然后收集集落.提取纯化集落细胞的DNA,经亚硫酸盐修饰后,采用甲基化特异PCR(MSP)检测CFU-HPP集落细胞的p16基因启动子甲基化状态.结果发现:在甲基纤维素半固体培养基中,银屑病患者骨髓CFU-HPP集落数显著低于正常对照(t=5.91,p＜0.01),且集落形态较小;正常对照骨髓CFU-HPP集落细胞的p16基因启动子甲基化阳性率较高(66.7%),而银屑病患者骨髓CFU-HPP集落细胞p16基因启动子甲基化阳性率(37.5%)低于正常人.结论:银屑病患者骨髓CFU-HPP细胞集落形成能力降低;银屑病患者骨髓CFU-HPP集落细胞的p16基因甲基化降低可能与其相对较低的CFU-HPP集落形成能力密切相关.
关键词： 银屑病 高增殖潜能集落形成单位 p16基因 基因甲基化
