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炎症微环境作用下经典及非经典Wnt通路平衡对牙周膜干细胞成骨分化的调控作用
目的 探讨炎症微环境作用下经典Wnt/β-联蛋白(β-catenin)与非经典Wnt/Ca2+通路的平衡对牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSC)成骨分化的调控作用.方法 收集解放军总医院口腔科2015年3至6月因治疗需要拔除的前磨牙和第三磨牙8颗及慢性牙周炎牙齿8颗,培养慢性炎症组织来源的PDLSC (PDLSC from patients diagnosed as periodontitis,P-PDLSC)与正常组织来源的PDLSC (PDLSC obtained from a healthy microenvironment,H-PDLSC).RNA干扰转染β-联蛋白至H/P-PDLSC,观察细胞状态并用蛋白质印迹法检测转染效果.实时定量PCR技术检测转染后Runt相关转录因子2 (Runt-related transcription factor 2,Runx2)、β-联蛋白及Nemo样激酶(nemo like kinase,NLK) mRNA表达.成骨诱导3d后蛋白质印迹法检测Ca2+/钙调素依赖型蛋白激酶Ⅱ(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ,CaMKⅡ)和NLK的表达,免疫荧光检测CaMKⅡ的表达.结果 蛋白质印迹法检测RNA干扰24 h抑制H/P-PDLSC siRNA β-联蛋白转染组中β-联蛋白的表达.成骨诱导3d后实时定量PCR结果显示,P-PDLSC siRNA β-联蛋白组Runx2(4.553±0.659)显著高于P-PDLSC空质粒转染组(1.918±0.315)(P=0.000),NLK mRNA表达(7.341±1.331)亦显著高于空质粒转染组(5.664±0.792)(P=0.030);与之相应的是蛋白质印迹法检测P-PDLSC siRNA β-联蛋白组与P-PDLSC空质粒转染组相比CaMKⅡ、NLK蛋白表达水平上升.免疫荧光检测结果显示,成骨诱导后H-PDLSC及P-PDLSC siRNA β-联蛋白组CaMKⅡ表达增强且高于H/P-PDLSC空质粒转染组.结论 炎症微环境作用下经典/非经典Wnt通路在PDLSC成骨分化过程中均发挥重要作用,抑制β-联蛋白可增强非经典Wnt/Ca2+通路,促进干细胞的成骨分化.
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Wnt经典通路β-catenin过表达对人牙周膜干细胞增殖能力及成骨能力的影响
目的:探讨Wnt经典通路β-连环蛋白(β-catenin)过表达对人牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)增殖能力及成骨能力的影响.方法:收集因治疗需要拔除的健康前磨牙和第三磨牙8颗,分离、培养PDLSCs.通过构建慢病毒过表达载体,转染β-catenin基因使实验组过表达β-catenin.转染后显微镜下观察常规培养及成骨诱导7d后细胞形态;MTT测定转染前后PDLSCs的增殖情况;实时定量PCR技术检测淋巴增强因子-1(LEF1)、T淋巴细胞因子-4(TCF4)、Runt相关转移因子-2 (Runt-related transcription factor 2,Runx2)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、人I型胶原蛋白-1 (Colossians 1,COL-1)及P38丝裂原活化蛋白激酶(P38mitogen activated protein kinases,P38 MAPK) mRNA表达.成骨诱导7d后,提取RNA,检测成骨相关基因Runx2、ALP、COL-1、P38 MAPK mRNA表达.结果:转染后细胞表达绿色荧光(green fluorescent protein,GFP).MTT结果示:β-catenin过表达组PDLSCs增殖能力较空转染组增强.β-catenin过表达组LEF1表达水平显著上升(P＜0.05),TCF4表达水平无显著性差异(P＞0.05);与空转染组相比β-catenin过表达组成骨诱导7d后Runx2、ALP、COL-1及P38表达水平显著降低(P.＜0.05).结论:经典Wnt/β-catenin通路在PDLSCs增殖及成骨分化过程中发挥重要作用,核心蛋白β-catenin过表达可上调LEF1的表达促进PDLSCs的增殖能力,并可通过下调RUNX2、ALP、COL-1、P38的表达抑制其成骨能力.
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经典Wnt通路与肿瘤放射抗性关系的研究进展
放疗是治疗恶性肿瘤的重要手段,放射抗性是影响放疗疗效的重要因素,也是放疗失败的主要原因之一.近年来经典Wnt信号通路与肿瘤放射抗性的关系,逐渐受到学者的关注.本文检索了近10年来有关经典Wnt信号通路与肿瘤放射抗性的相关研究,并进行综述,对经典Wnt信号通路参与放射抗性形成的分子机制及功能进行系统分析和梳理,力求寻找某些规律和不同作用途径的内在联系,为进一步深入研究寻找有价值的线索.
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阻断经典Wnt通路对棕色脂肪干细胞向起搏样细胞分化的作用
目的:研究阻断经典Wnt通路对棕色脂肪干细胞向起搏样细胞分化的影响.方法:在诱导棕色脂肪干细胞向起搏特性诱导的过程中,培养基中加入经典Wnt通路阻断剂Dkk-1培养10 d.相差显微镜观察诱导组细胞的形态学变化、应用real-time PCR检测其中起搏细胞发育相关结构基因的表达情况,免疫荧光显色普通光镜和激光共聚焦显微镜观察起搏特征分子的蛋白表达.结果:分化后的棕色脂肪干细胞具有起搏细胞特性,经Dkk-1诱导后,棕色脂肪干细胞向起搏样细胞的转化率明显提高,起搏细胞发育相关基因和蛋白表达明显上调.结论:阻断经典Wnt通路可促进棕色脂肪干细胞向起搏样细胞的分化.
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吴茱萸碱抑制Wnt通路诱导人胰腺癌细胞凋亡和自噬的作用研究
目的探讨吴茱萸碱诱导人胰腺癌细胞株BxPC-3和PANC-1凋亡和自噬的作用机制。方法不同浓度吴茱萸碱干预胰腺癌细胞株BxPC-3和PANC-1后，用甲基三氯硅烷（MTS）法检测吴茱萸碱对胰腺癌细胞增殖的影响，并用流式细胞术检测细胞凋亡情况。用蛋白质印记试验（Western blot）检测凋亡相关蛋白B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、自噬相关蛋白胞浆型（LC3-Ⅰ）和膜型（LC3-Ⅱ），以及Wnt通路下游靶分子c-Myc、细胞周期素D1（Cyclin D1）的表达水平。结果 MTS实验结果显示2μmol/L的吴茱萸碱干预48 h后的胰腺癌细胞株BxPC-3和PANC-1的存活率分别为（68.13±0.79）％和（57.19±1.47）％，明显低于未干预的胰腺癌细胞株，差异均有统计学意义（t分别=31.45、21.65，P均＜0.05）。4μmol/L的吴茱萸碱干预48 h后的胰腺癌细胞株BxPC-3和PANC-1的存活率分别为（55.07±1.97）％和（50.32±0.86）％，也低于2μmol/L吴茱萸碱干预的胰腺癌细胞株，差异均有统计学意义（t分别=6.13、4.02，P均＜0.05）。2μmol/L吴茱萸碱干预的BxPC-3和PANC-1胰腺癌细胞株凋亡率分别为（11.37±0.36）％和（11.36±0.32）％，明显高于未干预的胰腺癌细胞株BxPC-3和PANC-1凋亡率（4.60±0.90）％和（4.00±0.86）％，两组之间，差异有统计学意义（t分别=8.27、10.14，P均＜0.05）。2μmol/L吴茱萸碱干预的BxPC-3和PANC-1胰腺癌细胞株较未干预的胰腺癌细胞株凋亡蛋白Bcl-2表达明显下降， Bax表达明显增加；LC3-Ⅱ/LC-3Ⅰ比值分别为对照组的2.5倍和6.4倍；Wnt通路下游靶分子c-Myc和Cyclin D1的表达均明显降低。结论吴茱萸碱能够通过抑制Wnt通路的活性诱导胰腺癌细胞凋亡和自噬。
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经典Wnt信号通路在牙周膜细胞成骨分化过程中的调控
目的:探讨经典Wnt/β-catenin信号通路对牙周膜混合细胞群成骨分化过程中的调控作用.方法:体外组织块结合酶消化法培养牙周膜混合细胞群,通过RT-PCR、real-time PCR证实经典Wnt信号通路在牙周膜细胞中的表达,并运用细胞免疫荧光分析检测了β-catenin的表达位置及表达量;通过不同浓度的Licl激活牙周膜细胞中经典Wnt信号通路,并进行相应的诱导培养.培养14 d后,茜素红染色观察矿化结节形成情况,碱性磷酸酶活性检测ALP活性;通过CCK-8检测Licl刺激24h、48 h、72 h后经典Wnt信号通路对牙周膜细胞增殖的影响.以单因素重复测量方差分析比较差异.结果:经典Wnt/β-catenin信号通路在牙周膜混合细胞群中明显表达,可以通过Licl激活该信号通路,使β-catenin在细胞中累积引起下游变化;与对照组相比较,经典Wnt/β-catenin信号通路的激活引起牙周膜细胞矿化过程中矿化结节的减少,显著降低了ALP活性(P＜0.01);经典Wnt通路对牙周膜混合细胞群增殖表现为显著的抑制作用(P＜0.01).结论:经典Wnt/β-catenin信号通路抑制了牙周膜混合细胞群的矿化成骨过程,并抑制该细胞群的增殖.
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赖氨酸乙酰基转移酶2A通过经典Wnt通路影响牙周膜干细胞成骨分化
目的 探讨赖氨酸乙酰基转移酶2A(KAT2A)调控牙周膜干细胞(PDLSCs)成骨分化的机制.方法 分离培养来自健康志愿者的PDLSCs(H-PDLSCs)和牙周炎患者的PDLSCs(P-PDLSCs),比较传代细胞中KAT2A基因的表达水平.采用KAT2A基因干扰H-PDLSCs,检测KAT2A基因干扰对H-PDLSCs成骨分化的影响;同时检测KAT2A干扰后对经典Wnt通路及其配体的影响,确定KAT2A基因与经典Wnt通路的上下游关系.结果 与H-PDLSCs相比,P-PDLSCs中KAT2A基因的表达下降,差异有统计学意义(P＜0.05).KAT2A基因被干扰后,PDLSCs成骨能力下降(P＜0.05),同时经典Wn通路被激活,拮抗剂Dickkopf-1(DKK-1)表达下调;加入DKK-1后,被干扰的PDLSCs成骨分化功能恢复,而KAT2A的表达不受影响,仍维持较低水平.结论 牙周炎可导致PDLSCs中KAT2A基因表达下降,激活经典Wnt通路,抑制细胞的成骨分化.
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普鲁卡因与5'-氮杂-2'-脱氧胞苷对人肝肿瘤细胞株HepG2中Wif-1基因启动子甲基化影响的比较研究
目的 探讨普鲁卡因与5’-氮杂-2’脱氧胞苷(5'-Aza-2'-deoxycycytidine,5-aza-dc)对人肝肿瘤细胞株HepG2经典Wnt信号通路抑制因子-1(Wif-1)基因启动子脱甲基化作用的影响.方法 以普鲁卡因或5-aza-dc干预HepG2细胞,采用RT-PCR及Western blot检测干预前后Wif-1基因mRNA及蛋白的表达；甲基化特异性聚合酶链反应(methylation-specific polymerase chain reaction,MSP)检测干预前后HepG2细胞中Wif-1甲基化变化.结果 RT-PCR和Western blot结果显示经普鲁卡因或5-aza-dc作用前HepG2细胞Wif-1基因mRNA与蛋白呈低表达或缺失,经普鲁卡因或5-aza-dc作用后HepG2细胞Wif-1基因mRNA与蛋白呈高表达,各组间比较差异有统计学意义,且普鲁卡因实验组表达高于5-aza-dc实验组(P＜0.05).MSP结果显示,经普鲁卡因或5-aza-dc干预后HepG2细胞与干预前HepG2细胞比较均呈部分脱甲基化状态,对应的甲基化率分别为(14.41±3.37)％和(29.29±1.84)％(P＜0.05).结论 普鲁卡因及5-aza-dc均可影响Wif-1基因启动子CpG岛的甲基化状态.普鲁卡因可以作为一种新的去甲基化药物且效果优于常规药物5-aza-dc.
关键词： 经典Wnt通路 WIF-1 5’-氮杂-2’-脱氧胞苷 普鲁卡因 甲基化
