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人斯钙素1在大肠杆菌中的重组表达与活性鉴定
目的：通过原核表达的方法得到有活性的斯钙素1（ STC1）重组蛋白。方法将优化合成的STC1 DNA片段克隆到表达载体pET-32 b（＋）上，重组质粒转入大肠杆菌诱导表达，在变性条件下纯化包涵体，经透析复性得到可溶的斯钙素1融合蛋白，凝血酶酶切后用高亲和镍离子树脂吸附多余多肽获得目的蛋白。 Western印迹分析验证目的蛋白免疫活性。动物实验检测目的蛋白的生物学活性。结果构建了pET-32b（＋）-STC1表达载体，表达并纯化了STC1融合蛋白包涵体，经复性、凝血酶切和纯化后获得可溶的目的蛋白。 Western印迹分析验证正确。生物学活性检测表明重组STC1能增加大鼠排泄系统对磷酸盐的重吸收。结论获得了具有生物学活性的斯钙素1重组蛋白，为制备STC1单克隆抗体和进一步研究STC1与肿瘤治疗的关系奠定了基础。
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抗人IL-1β单链抗体的构建及其中和活性的检测
目的:原核表达抗人IL-1β(hIL-1β)的scFv,并对纯化后抗体的特异性、亲和力以及中和活性进行检测,为研制治疗类风湿关节炎的小分子抗体药物奠定基础.方法:使用PCR方法从含有抗hIL-1β抗体基因的质粒中获得抗hIL-1β的单链抗体基因,将其插入原核表达载体pET-27b(+)中,构建重组表达载体pET-27 b-A-hIL-1β-scFv.将该载体转化大肠杆菌Rosetta后诱导表达,经包涵体变性、复性得到可溶的抗hIL-1βscFv蛋白.利用高效液相色谱仪对其纯度进行分析后使用Western blot和ELISA方法测定scFv抗体对抗原特异性结合能力和亲和力,使用MTT的方法检测scFv抗体中和人IL-1β蛋白的能力.结果:成功地对抗hIL-1β单链抗体进行构建、诱导、表达和纯化.得到纯度为72.05％、相对分子质量约为28 ku的目的蛋白.ELISA和Western blot结果证实scFv蛋白对hIL-1β具有特异性结合能力.MTT实验结果证实该scFv抗体可以有效阻断hIL-1β刺激L929细胞的增殖.结论:通过原核表达系统得到的抗hIL-1β单链抗体,纯化后,鉴定其与hIL-1β蛋白有特异性结合能力,并且表现出中和hIL-1β的活性,为进一步研究治疗RA的小分子抗体奠定了基础.
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抗H5N1禽流感病毒羊驼重链单域抗体的制备和功能鉴定
目的:获得具有中和活性、高特异性和稳定性的抗H5N1禽流感病毒血凝素蛋白(HA)的羊驼重链单域(VHH)抗体.方法:利用pET-22b表达载体诱导表达抗H5N1禽流感病毒HA VHH抗体蛋白,以包涵体形式表达的VHH抗体蛋白采用优复性方法进行复性后,获得高纯度的VHH抗体,分别采用ELISA法鉴定VHH抗体的亲和力和热稳定性,采用血凝抑制实验鉴定抗体的特异性和体外中和活性.结果:经复性的抗H5N1禽流感HA VHH抗体对H5N1禽流感病毒HA具有良好的特异性.通过对三种不同复性方法比较,利用柱上复性的VHH23抗体具有较好的热稳定性,亲和力为9.1×10-7 mol/L,同时对H5N1禽流感病毒HA具有良好的体外中和活性.结论:实验结果表明通过原核表达获得具有较好中和活性、特异性及稳定性的抗H5N1禽流感病毒VHH抗体,为进一步开展抗体的体内病毒中和试验奠定良好基础.
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羊驼抗H5N1血凝素重链可变区-人IgGFc段嵌合抗体的制备和鉴定
本研究旨在制备羊驼抗H5N1禽流感病毒的重链抗体可变区-人Fc段嵌合体抗体制备,对所得嵌合抗体进行制备和功能鉴定,为临床应用奠定基础.用pET-22b表达载体构建抗H5N1禽流感病毒羊驼重链可变区(VHH)-人IgG1Fc嵌合基因,以包涵体形式表达VHH23-hFc嵌合抗体蛋白,采用优化的方法复性后,获得高纯度VHH23-hFc嵌合抗体,用ELISA法鉴定嵌合抗体亲和力、热稳定性和小鼠体内的半衰期.结果显示,透析复性后原核表达的抗H5N1禽流感病毒VHH23-hFc嵌合抗体亲和力为2.24×106 mol/L,具有较好免疫学活性,热稳定性也较好,小鼠体内半衰期达到35 h,为下一步开展该抗体的体内外病毒中和试验奠定良好基础.
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正交试验设计筛选scFv包涵体变性和复性工艺
单链抗体(single-chain variable fragment,scFv)包涵体的变性和复性受pH值、温度、盐浓度、氧化还原电对、添加剂等多种因素影响,快速找到合适的变、复性条件是蛋白质纯化的重点和难点.本试验以scFv-Z2为研究对象,通过正交试验设计筛选scFv-Z2包涵体的变性和复性条件,找出关键的影响因素,得到适变性条件:6 mol/L盐酸胍变性,变性时间24 h;适复性条件:以4 mol/L尿素、1 mol/L精氨酸(Arg)、1 mmol/L还原型谷胱甘肽(GSH)和0.02 mmol/L氧化型谷胱甘肽(GSGG)的溶液为复性液,样品与复性液比例为1:30,复性时间7d.通过SP阳离子柱分离后得到高纯度(99.2％) scFv-Z2单体,经工艺放大重复验证,终开发出稳定可靠的纯化工艺路线.本研究建立了正交试验设计在scFv-Z2包涵体纯化工艺开发中的新应用.
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重组兽疫链球菌透明质酸酶在大肠杆菌中的表达及其酶活力
以兽疫链球菌(Streptococcus zooepidemicus MF002)基因组为模板,利用PCR方法扩增透明质酸酶编码基因(hyl),将其插入温敏型质粒pBLMVL2,并导入大肠杆菌(Escherichia coli BL21),获得高效表达重组透明质酸酶的基因工程菌MF005.升温诱导试验和SDS-PAGE结果表明,重组蛋白的相对分子量约9.7×104,适诱导表达温度为41.5℃.经过包涵体复性等步骤获得的粗酶液具有透明质酸水解活性,比活力为2.3× 106 u/mg,适反应温度为37℃,适反应pH值为5.5.
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小鼠白细胞介素-15与其受体α亚单位协同作用的初步研究
目的 原核表达小鼠白细胞介素-15(mouse interleukin 15,mIL-15),并初步研究其与受体α亚单位(mIL-15Rα)的协同效应.方法 从小鼠肾脏组织克隆mIL-15成熟肽部分的基因片段,并亚克隆至原核表达载体pQE-30,所得重组表达质粒pQE-30/mIL-15转化E.coli M15.得到的转化子经IPTG诱导后获得重组表达产物,并进行SDS-PAGE和Western Blot检测.Ni-NTA亲和层析柱上纯化、复性重组蛋白,以获得成熟的mIL-15.采用MTT法检测重组mIL-15促CTLL-2细胞增殖的生物学活性,并进一步研究mIL-15与mIL-15Rα结合后协同促进靶细胞增殖的功能.结果 重组mIL-15主要以包涵体形式存在,其相对分子质量约为14ku,并能为抗His和抗mIL-15抗体所特异性识别.经Ni-NTA柱上蛋白纯化、包涵体复性后,可得到纯度约为95%的成熟蛋白.成熟mIL-15能够促进CTLL-2细胞增殖,并具有明显的量效关系;并且,在mIL-15Rα的配合下,mIL-15的促CTLL-2细胞增殖的活性显著增强,尤其是在低mIL-15浓度条件下该协同作用表现得愈发明显.结论 获得了具有生物活性重组mIL-15,并初步研究了其与mIL-15Rα组成复合物的体外协同效应.该研究成果为进一步研究IL-15 及IL-15Rα协同性的作用机理和开展小鼠成体免疫治疗研究奠定了基础.
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具有中和活性的抗人IL-1β单链抗体的构建
目的 构建抗人IL-1β单链抗体(anti-hIL-1β scFv)的原核表达载体,并对其表达的蛋白进行生物学活性检测.方法 使用PCR的方法从含有抗人IL-1β抗体基因的质粒中获得抗人IL-1β的单链抗体基因,将其插入原核表达载体pET-27b中,构建重组表达载体pET-27b-hIL-1β scFv.将该载体转化大肠杆菌Rosetta(DE3)后诱导表达,经凝胶过滤色谱柱上复性得到可溶的抗人IL-1β的scFv蛋白.使用ELISA方法鉴定scFv抗体的特异性结合活性,使用Real time-PCR的方法检测scFv抗体的中和活性.结果 成功地对抗人IL-1β单链抗体进行诱导、表达和复性,蛋白相对分子质量约为28 000.ELISA结果证实scFv蛋白对hIL-1β具有特异性结合能力.Real time-PCR实验结果证实该scFv抗体可以有效阻断人IL-1β刺激人T细胞表达细胞因子IL-18及IL-1β的作用.结论 通过原核表达系统得到的抗人IL-1β单链抗体经复性后,与人IL-1β蛋白有特异性结合能力,并且表现出中和活性,为进一步研究人IL-1β相关疾病及其治疗性抗体奠定了基础.
关键词： IL-1β 单链抗体 包涵体复性 中和活性 Realtime-PCR -
SARS冠状病毒Mc区原核表达及包涵体复性的研究
构建SARS冠状病毒M蛋白膜内区(Mc蛋白)基因(Mc区)融合表达载体,表达并复性该蛋白.克隆Mc区,构建融合表达载体pET-32a(+)/Mc,融合表达Mc蛋白.纯化表达蛋白,采用逐步透析、降低蛋白浓度、加入氧化还原剂复性融合蛋白.用复性蛋白免疫兔产生抗血清,复性蛋白与SARS患者血清和健康人血清反应鉴定复性结果.结果显示,复性蛋白免疫家兔后产生抗血清,该复性蛋白与SARS患者血清特异结合,表明已成功复性该表达蛋白.为SARS疫苗和诊断试剂的研制奠定基础.
