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CD44+/CD24+宫颈癌细胞和耐辐射宫颈癌细胞特性研究
目的 探讨放疗抵抗的宫颈癌细胞特性,揭示宫颈癌复发和转移的机制.方法 用多次分割照射获得耐辐射的宫颈鳞状细胞癌Siha细胞,利用流式细胞仪从宫颈鳞癌的亲代细胞中分选获得CD44 +/CD24+宫颈鳞癌细胞.将耐辐射的宫颈鳞癌细胞和CD44 +/CD24+宫颈鳞癌细胞设为实验组,亲代宫颈鳞癌细胞设为对照组,分别进行克隆形成实验和肿瘤移植瘤实验,评估实验组细胞是否具备肿瘤干细胞特性.通过Transwell侵袭实验研究实验组及对照组细胞侵袭和转移能力的差异.利用RT-PCR和Western blot检测实验组及对照组细胞OCT-4、Survivin、ABCG2和bcl-2 mRNA的表达,以及与肿瘤转移相关的E-cadherin和vimentin蛋白表达.结果 辐射抵抗的宫颈鳞癌细胞和CD44 +/CD24+宫颈鳞癌细胞较亲代宫颈癌细胞高表达抗凋亡蛋白Bcl-2(t=205.26、198.17,P＜0.05)和凋亡抑制蛋白survivin(t=896.62、765.34,P＜0.05),并表达肿瘤干细胞相关标志物OCT-4和ABCG2(t =92.13、81.26、220.45、216.32,P＜O.05).两组细胞均具有较强的致瘤能力以及侵袭和转移能力,且表现出E-cadherin下调和vimentin蛋白上调的EMT相关的分子表型变化.结论 放射抵抗的宫颈鳞癌细胞与CD44 +/CD24+宫颈鳞癌细胞表现出相同的肿瘤干细胞特性,经历了上皮间质转化过程,放射可以富集宫颈癌干细胞.
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乙醛脱氢酶1在宫颈癌发生发展中作用的研究进展
乙醛脱氢酶1 (ALDH1)是干细胞生长和分化的必需物质.国内外研究表明:ALDH1参与肿瘤干细胞的自我更新、分化和自我保护,与肿瘤的发生发展有密切关联,可作为肿瘤治疗的特异性靶点.本文作者将从ALDH1作为宫颈癌干细胞标志物及其与宫颈癌复发、转移、预后和放化疗抵抗等方面的研究进展进行综述.
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人乳头瘤病毒HPV16整合与宫颈病变程度的研究
目的：研究HPV 16整合与宫颈病变程度的关系，探讨反应宫颈病变的指标。方法收集感染HPV16的标本，慢性宫颈炎/CINⅠ25例(慢性宫颈炎21例，CINⅠ4例)，CINⅡ22例，CIN Ⅲ23例，宫颈癌28例，对不同HPV16质粒浓度的E2和E7基因进行定量PCR分析，制作标准曲线，得出游离型和混合型HPV16 E2/E7的临界值，并对样本进行扩增，根据临界值，分析HPV16整合在不同宫颈病变的分布情况。结果标准曲线制作良好，相关系数均在0.97以上；不同HPV16质粒浓度的E2/E7比值显示，0.77为游离型和混合型HPV16的临界值；根据该临界值，发现慢性宫颈炎/CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、宫颈癌的HPV16的整合率分别为4.00%、9.09%、13.04%、10.71%，统计显示HPV16整合率在不同宫颈病变中没有统计学差异(P>0.05)，因混合型HPV16也存在病毒整合，把整合型和混合型HPV16合并，得出HPV16总整合率在慢性宫颈炎/CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、宫颈癌分别为48.00%、59.09%、65.22%、75.00%，分析显示HPV16总整合率在各宫颈病变程度间亦不显著(P>0.05)，HPV16总整合率在宫颈病变的分布亦无差异。结论 HPV16整合与宫颈病变程度的关系不明显，病毒整合是宫颈病变的早期事件，不能反应宫颈病变程度的变化。
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宫颈癌干细胞相关标记物的研究进展
宫颈癌具有很强的侵袭力，其复发与转移严重影响患者的预后与生存。随着肿瘤干细胞学说的兴起和发展，妇科肿瘤专家也开始关注肿瘤干细胞在宫颈癌发生、发展中的作用，试图通过研究其生物学特性为宫颈癌的诊治开辟新的思路。目前，宫颈癌干细胞的研究还处于初级阶段，已有证据支持宫颈癌干细胞的存在，但尚无明确的标记物。本文就肿瘤干细胞理论、宫颈癌干细胞标记物、宫颈癌干细胞的分离和鉴定做一简单综述。
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宫颈癌干细胞表面标志物的研究进展
宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤之一,随着TCT及阴道镜病理活检的广泛应用,我国宫颈癌的早期发现、早期治疗均取得了很大进展,但晚期宫颈癌患者的治疗,目前方法不多,效果也欠佳.随着干细胞技术的兴起和发展,学者们发现,肿瘤细胞表现出的增生和分化能力与干细胞极其相似.本文现对宫颈癌干细胞可能的来源、肿瘤标志物及治疗前景做一简单综述,旨在为探讨宫颈癌发病机制提供新思路,为宫颈癌的病因、诊断及治疗策略开辟新的方向.
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miR-23b转染宫颈癌干细胞顺铂化疗敏感性变化及其机制
目的 观察微小RNA-23b(miR-23b)转染对宫颈癌干细胞(CD133+CaSki细胞)顺铂(CDDP)化疗敏感性的影响,并探讨其机制.方法 流式细胞术分选宫颈癌细胞系CaSki中的CD133+CaSki细胞,荧光定量PCR检测CD133+CaSki细胞和宫颈癌非干细胞(CD133-CaSki细胞)中的miR-23b,并预测其靶基因.将CD133+CaSki细胞分为mimics组、NC组、空白对照组,mimics组转染miR-23b模拟物(miR-23b mimics),NC组转染miR-23b阴性对照物(miR-23b NC),空白对照组不做任何处理,之后分别加入不同浓度的CDDP,CCK-8法检测CDDP对各组CD133+CaSki细胞的半数抑制浓度(IC50).Western blotting法检测CD133+CaSki、CD133-CaSki、转染miR-23b mimics的CD133+CaSki细胞中乙醛脱氢酶1A1(ALDH1A1)蛋白.将人胚胎肾细胞系HEK-293T分为wt组、mut组、空载体组,wt组转染miR-23b mimics、内参质粒SV40、pmirGLO-ALDH1A1-3′-UTR wt(野生型)荧光素酶质粒,mut组转染miR-23b mimics、内参质粒SV40、pmirGLO-ALDH1A1-3′-UTR mut(突变型)荧光素酶质粒,空载体组转染miR-23b mimics、内参质粒SV40、pmirGLO空载体质粒,采用双荧光素酶试验检测各组细胞中转染质粒编码蛋白的萤光强度.结果 CD133+CaSki、CD133-CaSki细胞中miR-23b的相对表达量分别为0.29±0.05、1.09±0.14,两者相比,P<0.01;miR-23b的预测靶基因为ALDH1A1基因.CDDP对mimics组、NC组、空白对照组细胞的IC50分别为(8.18±1.02)、(13.98±1.48)、(14.15±1.27)μg/mL,mimics组与NC组和空白对照组相比,P均<0.05.CD133+CaSki、CD133-CaSki、转染miR-23b mimics的CD133+CaSki细胞中ALDH1A1蛋白相对表达量分别为0.29±0.06、0.12±0.03、0.13±0.04,ALDH1A1蛋白在CD133+CaSki细胞中的相对表达量与CD133-CaSki细胞和转染miR-23b mimics的CD133+CaSki细胞相比,P均<0.05.HEK-293T细胞中,wt组、mut组、空载体组转染质粒编码蛋白的萤光强度分别为0.41±0.06、1.12±0.15、1.02±0.15,wt组转染质粒编码蛋白的相对荧光强度与mut组和空载体组相比,P均<0.05.结论 在CD133+CaSki细胞中,miR-23b表达水平降低,CDDP的IC50升高,AL-DH1A1蛋白表达增加;CD133+CaSki细胞转染miR-23b后,CDDP的IC50降低;HEK-293T细胞转染miR-23b后,抑制ALDH1A1基因表达.
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姜黄素对宫颈癌干细胞增殖、聚集及化疗敏感性的影响
目的 探讨姜黄素对宫颈癌干细胞增殖、聚集及化疗敏感性的影响.方法 用流式细胞术从人官颈癌细胞株CASKI中分选CD133+的宫颈癌干细胞.将宫颈癌干细胞随机分为七组,CC10组、CC20组、CC40组、CC60组、CC80组及CC100组分别给予终浓度为10、20、40、60、80、100 mg/mL姜黄素进行培养,对照组给予等量溶剂与培养基培养.用MTr法检测各组细胞增殖抑制率.取对照组、CC60组细胞用无血清培养基培养1周,光镜下计数聚集的直径大于100 μm的干细胞球个数,流式细胞术检测官颈癌干细胞比例.取宫颈癌干细胞随机分为BV组、CC组、BV+ CC组、对照组四组,分别加入10 mg/mL贝伐单抗、60 mg/mL姜黄素、10 mg/mL BV+ 60 mg/mL姜黄素、等量溶剂与培养基,培养48 h后采用流式细胞术测算细胞凋亡率.结果 CC10组、CC20组、CC40组、CC60组、CC80组、CC100组细胞增殖抑制率均高于对照组(P均＜0.05);且随着姜黄素浓度的增加,宫颈癌干细胞增殖抑制率逐渐升高(P均＜0.05).CC60组直径大于100 μm的干细胞球个数少于对照组(P＜0.05),干细胞比例低于对照组(P＜0.05).BV+ CC组细胞凋亡率高于对照组、BV组、CC组(P均＜0.05),CC组高于对照组、BV组(P均＜0.05),BV组高于对照组(P均＜0.05).结论 姜黄素可抑制宫颈癌干细胞增殖,降低其聚集能力,增加其对贝伐单抗的治疗敏感性.
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泛素水解酶22siRNA对宫颈癌CD133+宫颈癌干细胞增殖和侵袭的影响
[目的]采用USP22 siRNA对宫颈癌CD133+CaSki宫颈癌干细胞进行基因治疗,观察其对USP22含量和对增殖侵袭能力的影响,并对其分子生物学机制进行初步探讨.[方法]流式分选获得CD133+ CaSki宫颈癌干细胞,分为USP22组、阴性对照(NC)组、空白对照组(MOCK)组.采用western blot法比较各组细胞USP22蛋白的含量,MTT法检测3组细胞的增殖能力,Transwell法检测3组细胞的侵袭能力,荧光素酶报告基因实验检测3组细胞Wnt/β-catenin信号通路的活性.[结果]采用流式细胞术分选CD133阳性细胞后CaSki细胞CD133阳性率为(96.87±5.31)％,显示流式分选宫颈癌干细胞成功(P＜0.05).Western blot检测结果显示,USP22组CD133+ CaSki细胞中USP22蛋白表达量明显降低.MTT结果显示USP22组细胞增殖能力明显减弱,差异具有统计学意义(P＜0.05).Transwell实验结果显示USP22组CD133+CaSki细胞侵袭能力明显受到抑制,差异具有统计学意义(P＜0.05).荧光素酶报告基因实验结果显示,USP22组Wnt/β-catenin信号通路的转录活性明显降低,差异具有统计学意义(P＜0.05).[结论]USP22 siRNA有降低CD133+ CaSki宫颈癌干细胞内Wnt/β-catenin信号通路活性的作用,进而可以实现对宫颈癌干细胞增殖和侵袭功能的抑制,该治疗方法有望成为宫颈癌基因治疗的新手段.
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自噬对宫颈癌细胞干性及增殖能力的影响
目的:研究自噬对宫颈癌细胞干性及增殖能力的影响.方法:采用悬浮培养法分离HeLa肿瘤干细胞,免疫荧光检测干细胞标志基因CD133和Nanog,吖啶橙染色观察自噬小体的形成;Western blot检测贴壁细胞和肿瘤干细胞中自噬相关基因Beclin1和LC3B的表达情况;贴壁细胞和肿瘤干细胞平衡盐溶液EBSS饥饿处理4h和8h后,吖啶橙染色观察自噬小体的形成,Western blot检测Beclin1和LC3B表达,实时细胞检测系统检测野生型和饥饿处理后HeLa细胞的增殖能力;自噬抑制剂3-methyladenine(3-MA)阻断宫颈癌贴壁细胞和干细胞的自噬后,Western blot检测Beclin1和LC3B表达,实时细胞检测系统检测野生型和自噬抑制剂处理后HeLa细胞的增殖能力;运用CRISPR/Cas9基因编辑技术降低自噬基因Beclin1的表达,通过实时细胞检测系统检测野生型和Beclin1突变HeLa细胞的增殖能力.结果:基础水平下,HeLa肿瘤干细胞比HeLa贴壁细胞自噬水平高.饥饿诱导处理后,HeLa肿瘤干细胞和HeLa贴壁细胞自噬水平均增高,均在4h强,8h后有所减弱,且HeLa肿瘤干细胞在饥饿诱导各时间点均比HeLa贴壁细胞强;HeLa细胞饥饿处理4h和8h后增殖能力均有所下降,8h下降更明显.应用3-MA后,HeLa肿瘤干细胞和HeLa贴壁细胞自噬均减弱,且HeLa贴壁细胞自噬减弱更为明显;细胞增殖能力也明显减弱.Beclin1突变后HeLa细胞较野生型HeLa细胞增殖能力增强.结论:自噬参与维持宫颈癌HeLa细胞的干性.同时,自噬也能影响宫颈癌HeLa细胞的增殖能力.通过基因打靶扰乱自噬关键基因(如Beclin1或LC3B等)而改变宫颈癌细胞自噬水平可为宫颈癌的治疗带来新的治疗策略.
