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丁基苯酞抗大鼠大脑皮质神经元氧糖剥夺/复氧损伤及其机制
本研究探讨丁基苯酞抗大鼠大脑皮质神经元氧糖剥夺/复氧损伤及其机制.原代培养大鼠大脑皮质神经元,建立氧糖剥夺/复氧模型(OGD/R),采用MTT法、酶学检查、免疫组化、RT-PCR等观察丁基苯酞(各浓度组)的保护作用及其机制.在氧糖剥夺4 h/复氧8 h时丁基苯酞各浓度组可增加神经元的细胞活力和减少神经元LDH(乳酸脱氢酶)的释放,可显著降低神经元表达iNOS mRNA(诱生型一氧化氮合酶)和NF-κB(核因子κB)p65蛋白(增加).不同剂量丁基苯酞(100、10、1和0.1 μmol·L-1)在增加细胞活力、减少LDH释放及降低神经元表达iNOSmRNA等方面,高浓度的作用强于低浓度,且丁基苯酞100 μmol·L-1组与吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)100 μmol·L-1组差异显著.在OGD 4 h/R 8 h时丁基苯酞可能抑制iNOSmRNA的表达及NF-κB的活化,从而有效保护氧糖剥夺/复氧中损伤的大脑皮质神经元.
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氟砷联合染毒对大鼠神经元超微结构影响
目的 探讨氟、砷及联合染毒对大鼠海马、大脑皮质神经元及神经突触超微结构影响.方法 初断乳SPF级SD大鼠随机分为4组,氟、砷处理组大鼠分别自由饮用120 mg/L氟化钠(NaF)和70 mg/L亚砷酸钠(NaAsO2)水溶液,氟砷联合染毒组饮用120 mg/L NaF +70 mg/L NaAsO2混合水溶液,对照组饮用蒸馏水;各组大鼠染毒3个月,用透射电子显微镜观察各组大鼠海马、大脑皮质神经元和突触超微结构变化.结果 氟处理组和联合染毒组大鼠海马、大脑皮质组织氟含量分别为(1.14 ±0.35)、(1.06±0.27)、(1.19±0.42)、(1.03±0.21)μg/g,均高于对照组的(0.24 ±0.18)、(0.25 ±0.07) μg/g;砷处理组和联合染毒组大鼠海马、大脑皮质组织砷含量分别为(3.92±0.63)、(3.80±0.76)和(3.73±0.99)、(3.43 ±0.63) μg/g,均高于对照组的(0.16±0.03)、(0.14 ±0.02)μg/g;电镜观察可见氟、砷处理组和联合染毒组大鼠海马、大脑皮质神经元出现不同程度皱缩、核变形,胞浆内细胞器减少,线粒体肿胀、空化等;突触前膜突触小泡减少,线粒体内嵴结构不完整,突触后膜膨大水肿,线粒体空化变性等.结论 氟、砷及联合染毒均可引起大鼠海马、大脑皮质神经元及突触超微结构病理改变.
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阿魏酸及其酯化产物与体外培养大鼠大脑皮质神经元的存活
背景:大量体外筛选中得到的中药脑神经保护活性成分,多因脂溶性低难以透过血脑屏障而限制了其临床应用.目的:比较阿魏酸及其酯化产物阿魏酸甲酯、乙酯对原代培养的大鼠大脑皮质神经元体外存活的保护作用.方法:出生1 d内的乳鼠采用酶消化法分离培养大脑皮质神经元.培养6 d后,分别进行阿魏酸、阿魏酸甲酯及乙酯干预,继续培养1 d.结果与结论:形态学观察结果显示细胞生长良好,NSE 染色检查表明培养6 d 的存活细胞大部分均为神经元.MTT 比色法测量结果显示,与空白对照组比较,阿魏酸仅在质量浓度为200 mg/L 时有明显促进大脑皮质神经元存活的作用,而阿魏酸甲酯、乙酯在质量浓度为0.16~20 mg/L 时均能明显促进神经元体外存活,且作用趋势、作用强度相近.表明阿魏酸的酯化产物阿魏酸甲酯和阿魏酸乙酯均能促进原代培养的大脑皮质神经元体外存活,显示出较好的脑神经元保护作用,且活性比阿魏酸更强.
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人巨细胞病毒体内外先天性感染胎鼠脑神经元的研究
目的:研究确定人巨细胞病毒(HCMV)体内外先天性感染胎鼠大脑皮质神经元及其感染特征.方法:分别建立体内外模拟HCMV先天性感染小鼠脑神经元模型.采用病毒分离、病理学检测及核酸原位杂交技术等观察研究病毒的增殖,受染细胞的形态特征以及病毒核酸在细胞内的定位和分布.结果:体内模型显示:脑组织上清液中分离出HCMV;大脑皮质发生侵袭性脑膜脑炎性病理改变;神经元核内出现病毒特征性大的嗜碱性包涵体;病毒特异性核酸存在于受染神经元核内及胞浆内.体外模型亦证实:受染神经元胞体明显肿胀并可见核内嗜酸性包涵体;原位杂交法检出HCMV特异性核酸.结论:HCMV可在体内外致胎鼠大脑皮质神经元发生类似于人类先天性中枢神经系统感染的病理改变;建立的体内外感染模型可用于HCMV中枢神经系统先天性感染的发生机制研究.
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甘草甜素对癫痫持续状态大鼠神经保护作用及机制研究
目的 研究甘草甜素(glycyrrhizin,GL)对癫痫持续状态大鼠(status epilepticus,SE)神经损伤保护作用及相关分子机制.方法 取清洁健康成年雄性SD大鼠60只,采用腹腔注射氯化锂-匹罗卡品的方法建立大鼠癫痫持续状态(SE)模型,随机分为甘草甜素组(SE+GL)和生理盐水组(SE+S),分别经尾静脉给予甘草甜素及生理盐水进行干预,取正常大鼠作为对照组(control group,C);根据给予GL剂量不同将其分为高剂量组(HGL,20 mg/kg)、中剂量组(MGL,10 mg/kg)及低剂量组(LGL,5 mg/kg);通过尼氏染色(NS)观察各组大鼠SE后24 h时大脑皮质神经元损伤情况,分别采用酶联免疫吸附法(ELISA)和蛋白印迹实验(Western blot)检测各组大鼠SE后24 h时血清及大脑皮质中高迁移率族蛋白(HMGB1)的表达水平.结果 SE+S组大鼠大脑皮质神经元在癫痫持续状态后24 h明显受损,SE+GL各组皮质受损神经元数量较SE+S组减少,且在不同给药剂量组间存在显著差异(P<0.05);SE+GL各组在SE后24 h时大脑皮质及血清中HMGB1的表达水平较SE+S组显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05).结论 经尾静脉给予GL能有效地减少SE后大鼠大脑皮质神经元损伤,且其神经保护作用呈剂量依赖性,其机制可能与其抑制血清及大脑皮质炎性因子HMGB1的表达有关.
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苯妥英对缺氧大鼠大脑皮质神经元钙激活钾通道的影响
目的:研究苯妥英对缺氧大鼠大脑皮质神经元钙激活钾[K(Ca)]通道的影响.方法:应用膜片钳单通道技术记录苯妥英对缺氧大鼠大脑皮质神经元上K(Ca)通道电流活动.电流信号经放大、滤波及转换后输入微机进行采样、储存和分析.结果:苯妥英对缺氧大脑皮质神经元K(Ca)通道具有明显的激活作用,主要是增加通道的开放概率(open probability,Po).结论:苯妥英激活大脑皮质神经元K(Ca)通道,产生超极化电位,从而稳定细胞膜,降低细胞兴奋性,延缓缺氧除极的发生,这可能是苯妥英抗缺血脑损伤的另一个重要机制.
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激活α7烟碱型乙酰胆碱受体减轻大脑皮质神经元氧糖剥夺损伤
目的 研究激活α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7 nicotinic acetylcholine receptor,α7nAchR)对大脑皮质神经元氧糖剥夺损伤的作用及可能机制.方法 取体外培养7d的原代大脑皮质神经元,随机分为3组:对照组、氧糖剥夺组、PNU-282987(α7nAchR激动剂)组.氧糖剥夺组细胞氧糖剥夺12 h;PNU-282987组用PNU-282987预处理细胞24 h,然后氧糖剥夺12h.采用CCK-8测定3组大脑皮质神经元存活率,比色法检测上清液乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenate,LDH)含量,流式细胞术检测细胞凋亡率和活性氧(reactive oxygen species,ROS)产量,蛋白质印迹法检测血红素氧化酶(hemeoxygenase-1,HO-1)、缺氧诱导因子1α (hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)表达量.结果 与氧糖剥夺组相比,PNU-282987可提高大脑皮质神经元存活率(P＜0.05),降低LDH含量(P＜0.05),抑制细胞凋亡(P＜0.05),降低ROS产量(P＜0.05),同时使HO-1蛋白表达升高、HIF-1α蛋白表达减少(P＜0.05).结论 激活α7nAchR具有抗大脑皮质神经元氧糖剥夺损伤作用,该作用可能与抗氧化应激有关.
关键词： α7烟碱型乙酰胆碱受体 大脑皮质神经元 氧糖剥夺 氧化性应激 -
大脑皮质神经元氧糖剥夺/复氧后NF-κB P50及c-Rel蛋白的表达
目的:探讨Wistar大鼠大脑皮质神经元氧糖剥夺/复氧(OGD/R)后不同时间点NF-κB亚基P50及c-Rel蛋白表达情况.方法:体外培养原代大脑皮质神经元,采用免疫细胞化学鉴定神经元,建立氧糖剥夺/复氧模型,以正常组、OGD 4 h组、OGD 4 h/R 2 h组、OGD 4 h/R 6 h组、OGD 4 h/R 12 h组、OGD 4 h/R 24 h组为实验组,采用免疫细胞化学、Western印迹检测NF-κB亚基P50及c-Rel蛋白表达.结果:(1)免疫细胞化学(神经元烯醇化酶相关抗原及β-tubulin 3)鉴定所培养的细胞为神经元;(2)免疫细胞化学、Western印迹结果显示OGD 4 h组NF-κB P50蛋白表达开始增加明显高于正常组(P<0.05),0GD 4 h/R 2 h组、OGD 4 h/R 6 h组NF-κB P50蛋白表达持续性升高,并在复氧后6 h达高峰(P<0.01),此后逐渐下降,至OGD 4 h/R 12 h时与正常组有显著差异(P<0.05),OGD 4 h/R 24 h NF-κB P50蛋白表达降低与正常组比较无统计学差异(P<0.05);(3)NF-κB c-Rel蛋白表达OGD 4 h组与正常组无差异(P>0.05),OGD 4 h/R 2 h至OGD 4 h/R 12 h表达持续增加,并在复氧后12 h达高峰(P<0.01),OGD 4 h/R 24 h仍未恢复到正常水平(P<0.05).结论:大鼠大脑皮质神经元氧糖剥夺/复氧后激活了NF-κB P50及c-Rel蛋白的表达,并具有时间相关性.
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骨髓间充质干细胞条件培养基对缺氧大鼠神经元凋亡的影响
目的 观察大鼠骨髓间充质干细胞(BMMSCs)条件培养基(B-CM))对缺氧大鼠大脑皮质神经元凋亡的影响.方法 分离、培养、传代Wistar大鼠BMMSCs,细胞融合达90%时更换培养基,继续培养24 h后收集培养上清液即B-CM;取培养8 d的新生Wistar大鼠大脑皮质神经元,分正常对照组、缺氧组、B-CM组,分别于缺氧0、6 h、复氧24 h用四甲基偶氮唑盐微量反应比色(MTT)法检测各组细胞活性,用流式细胞仪和透射电镜技术检测神经元凋亡情况.结果 神经元缺氧6 h细胞活性较对照组明显降低,复氧24 h后细胞凋亡率明显升高(P＜0.01).B-CM培养后细胞活性和缺氧前无差异,细胞凋亡明显较少(P＜0.01).结论 B-CM对缺氧-复氧引起的神经元凋亡有明显的防护作用.
关键词： 骨髓间充质干细胞条件培养基 缺氧-复氧 大脑皮质神经元 凋亡 -
加味温胆汤对亚急性衰老大鼠大脑皮质超微结构改变的影响
在电镜下观察了加味温胆汤对D-半乳糖亚急性衰老大鼠大脑皮质神经元超微结构改变的影响,并对其主要细胞器进行了计量分析.结果表明:模型组脂褐素数量较正常组增多(P＜0.05),线粒体则减少(P＜0.05)同时还发现溶酶体、脂褐素大小形态不规则,线粒体肿胀、变性、嵴断裂、空泡样变,核膜内褶断裂,核仁边移等衰老改变,而加味温胆汤则使上述变性程度减轻,从而表明该方能延缓脑衰老,并提示该方可能具有稳定神经细胞生物膜系统作用.
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hTERT基因转染对人胚胎大脑皮质神经元生长的影响
目的 观察hTERT基因转染后对人胚胎大脑皮质神经元生长活力的影响.方法 制备pSU-CMV-hTERT腺病毒,以MOI感染人胚胎大脑皮质神经元.免疫细胞化学荧光染色观察神经元内hTERT表达.MTY法测量接种病毒后24 h、72 h、1周、2周、3周的神经元活力.结果 经鉴定正确的重组质粒pSU-CMV-hTERT与骨架质粒正确重组,经包装扩增后得到含hTERT基因的腺病毒.病毒转染24 h时荧光染色可见神经元内有hTERT表达.第3周末表达减弱.hTERT基闪转染后的神经元平均活力较对照组高,转染病毒后24 h、72 h、1周、2周、3周,hTERT基因转染对神经元的保护率分别为27.4%、42.4%、17.3%、7.4%和15.9%.结论 hTERT基因转染对人胚胎大脑皮质神经元有一定的保护作用.
关键词： 人端粒酶催化亚基(hTEET) 端粒酶 大脑皮质神经元 阿尔茨海默病 -
NF-κB靶向性哑铃形"圈套"ODNs抑制大脑皮质神经元氧糖剥夺/复氧后TNF-α的表达
目的 设计合成靶向哑铃形寡核苷酸(oligodeoxynucleotides,ODNs)圈套,检测其对大鼠大脑皮质神经元氧糖剥夺/复氧(OGD/R)后TNF-α表达的抑制效应.方法 原代大脑皮质神经元体外培养,建立氧糖剥夺/复氧模型,以正常组、OGD4 h/R6 h组、NF-κB decoy ODNs组、无关decoy ODNs组、脂质体组为实验组,采用Western blot检测NF-κB p65蛋白表达,分别采用免疫细胞化学和逆转录-聚合酶链反廊法(RT-PCR)检测FNF-α蛋白和mRNA表达.结果 Westernblot检测显示NF-κB decoy ODNs组NF-κB P65蛋白表达明显低于OGD4 h/R6 h组、脂质体组、无关decoy ODNs组(P<0.05),与OGD4 h/R6 h组、脂质体组、无关decoy组相比NF-κB decoy ODNs组TNF-α蛋白和mRNA表达明显降低(P<0.05);而脂质体组、无火decoy ODNs组对NF-κB P65蛋白、TNF-α蛋白和mRNA表达未见抑制(P>0.05).结论 靶向性NF-κB的哑铃形圈套ODNs可有效抑制大脑皮质神经元OGD/R后炎症因子TNF-α mRNA及蛋白的表达.
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SYK调控缺氧/缺糖损伤诱导的大脑皮质神经元凋亡及其机制
目的 探讨抑制脾酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase,SYK)对缺氧/缺糖损伤诱导的大脑皮质神经元的凋亡的影响及相关机制.方法 分离培养10只SD怀孕大鼠(190 ～230 g,胎龄16d)胎鼠的大脑皮质神经元细胞并用MAP2免疫荧光法进行鉴定.建立缺氧/缺糖损伤的体外模型,caspase-3荧光检测试剂盒检测caspase-3活性,Annexin-V FITC/PI法检测细胞凋亡,qRT-PCR检测SYK和凋亡相关的原癌基因Fra-1 mRNA的表达,Western Blot检测SYK、Bcl-2和Fra-1蛋白的表达.Control组:无转染处理的缺氧/缺糖损伤的神经元;SYK siRNA组:转染SYK siRNA的缺氧/缺糖损伤的神经元;SYK-Fra-1 siRNA组:同时转染SYK siRNA和Fra-1 siRNA的缺氧/缺糖损伤的神经元;non-specific siRNA组:转染non-specific siRNA的氧/缺糖损伤的神经元.结果 MAP2免疫荧光鉴定为神经元细胞.缺氧/缺糖损伤诱导神经元SYK表达(P＜0.01),RNA干扰抑制SYK表达后caspase-3活性(P＜0.05)和细胞凋亡(P＜0.01)均显著降低,但是Fra-1 mRNA (P ＜0.01)和蛋白(P＜0.05)表达量明显上升.用RNA干扰技术同时抑制SYK和Fra-1后,caspase-3活性(P＜0.01)显著上升但Bcl-2蛋白表达(P＜0.01)显著降低.结论 Fra-1介导了SYK对缺氧/缺糖损伤诱导的神经元凋亡的调节,为脑卒中所致的神经元缺血性损伤的治疗提供了新的靶点.
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小鼠大脑皮质神经元电穿孔转染条件的优化
目的:以原代培养的小鼠大脑皮质神经元为研究工具,优化电穿孔转染条件.方法:通过设置不同的电压和脉冲时间组合等电转染条件,将表达绿色荧光蛋白(GFP)的shNC质粒导入小鼠大脑皮质神经元,24 h后观察并比较神经元的转染效率,确定佳电转染条件.结果:200 v电压,25 ms,脉冲时间或250 v电压,15 ms脉冲时间的转染条件下,小鼠大脑皮质神经元可获得较好的转染效率,分别为(31.15±1.89)%和(29.10±1.93)%.结论:电穿孔转染是一种高效的基因转染方法,通过条件的优化,可以提高小鼠大脑皮质神经元的电转染效率.
