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知母皂苷元改善淀粉样β蛋白引起的体外培养乳大鼠海马神经元的损伤
目的 探讨知母皂苷元(Sar)对淀粉样β蛋白片段1-42(Aβ1-42)引起的海马神经元损伤是否有保护作用.方法 取出生24 h内SD乳大鼠海马神经元,体外培养7d,先加入Sar 10,30和100 μmol·L-1作用1h,然后加入Aβ1-42 50 nmol· L-1作用24 h.应用倒置相差显微镜和微管相关蛋白2(MAP2)免疫荧光染色观察神经元树突的生长;应用Hoechst33258核染色检测神经元凋亡;Western蛋白质印迹法检测海马神经元突触囊泡蛋白(SYP)、突触后致密蛋白95(PSD95)和活性胱天蛋白酶3表达.结果 加入Aβ1-42作用24 h,可使培养海马神经元树突静脉曲张样改变和突起回缩,树突总长度和末梢分枝数明显减少.与正常对照组相比,SYP和PSD95蛋白表达水平明显降低(P＜0.01),神经元凋亡细胞百分率和活性胱天蛋白酶3蛋白表达水平明显升高(P＜0.01).与Aβ1-42模型组相比,先分别加入Sar 30和100 iμmol·L-1可明显对抗Aβ1-42引起的这些改变,培养海马神经元树突总长度(μm)和末梢分枝数从277 ±76和6±2分别增加到359±144和8±3以及370±158和8±3,神经元SYP和PSD95蛋白表达水平明显增加(P＜0.01),神经元凋亡细胞百分率和活性胱天蛋白酶3表达水平明显降低(P＜0.01).结论 Sar能够改善Aβ1-42引起的海马神经元损伤.
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知母皂苷元通过上调PI3K/Akt信号通路减轻淀粉样β蛋白诱导的乳大鼠海马神经元突触损伤
目的 探讨知母皂苷元(Sar)减轻淀粉样β蛋白(Aβ)诱导的海马神经元突触损伤的信号转导机制.方法 取出生0 ～24 h SD乳大鼠海马神经元,体外培养7d.海马神经元分别加入磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)特异性阻断剂LY294002 30 μmol· L-1或蛋白激酶B(Akt)特异性阻断剂曲西立滨1 μmol· L-11h后,加Sar 30和100 μmol· L-1作用1h,再加Aβ1-42 50 nmol· L-1作用24 h.应用突触囊泡蛋白(SYP)免疫荧光染色观察突触的改变.Western蛋白质印迹法检测海马神经元SYP、磷酸化Akt(p-Akt)和磷酸化糖原合成酶3β(p-GSK3β)表达水平的改变.结果 与正常对照组相比,Aβ1-42组培养的海马神经元SYP,p-Akt和p-GSK3β表达水平明显减低(P＜0.01).与Aβ1-42组相比,Aβ1-42+Sar 30和100 μmol·L-1组海马神经元SYP,p-Akt和p-GSK3β表达水平明显增加(P＜0.01).给予LY294002作用后,SYP和p-Akt表达水平明显降低(P＜0.05).给予曲西立滨作用后,SYP和p-GSK3β表达水平明显降低(P＜0.05).单独给予LY294002,海马神经元SYP表达无变化,p-Akt表达水平明显降低(P＜0.01).单独给予曲西立滨,海马神经元SYP和p-GSK3β蛋白表达水平明显降低(P＜0.01).结论 Sar通过上调PI3K/Akt/GSK3β信号通路对抗Aβ1-42诱导的海马神经元突触损伤.
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知母皂苷元对HEK293sw细胞APP和BACE1的影响
目的 探讨知母活性成分知母皂苷元(ZMS)对HEK293sw细胞淀粉样前体蛋白(APP)和β-位点APP切割酶1(BACE1)的影响.方法 常规培养HEK293sw细胞,加入不同浓度ZMS预处理24 h后,换为无血清培养,继续处理48 h后观察ZMS的作用.Western blotting和RT-PCR技术测定APP和主要β-分泌酶BACE1的表达;荧光分析法测定BACE1活力.结果有效终浓度1 μmol/L和10 μmol/L的ZMS对BACE1的mRNA和蛋白表达均有显著降低作用,但对APP的mRNA和蛋白表达无明显影响.荧光分析结果显示,10 μmol/L ZMS能显著降低BACE1活力.结论 ZMS显著降低HEK293sw细胞主要β-分泌酶BACE1的表达及活力,而对APP的表达无明显影响.
关键词： 知母皂苷元 HEK293sw细胞 β-分泌酶 淀粉样前体蛋白 -
知母皂苷元对成骨细胞活性和破骨细胞分化及功能的影响
目的:考察知母皂苷元(SAR)对体外培养成骨细胞活性和破骨细胞分化及功能的影响.方法:培养小鼠胚胎成骨细胞MC3T3-E1,分别采用MTT法、碱性磷酸酶(ALP)试剂盒检测及茜素红染色法观察SAR对MC3T3-E1细胞增殖、ALP活性及矿化结节形成的影响;分别采用皮质骨来源破骨细胞分离及骨髓间充质干细胞诱导破骨细胞形成两种方法培养破骨细胞,利用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)阳性细胞计数及骨吸收陷窝计数来观察不同浓度SAR对成熟破骨细胞活性及破骨细胞诱导分化的影响.结果:与对照组相比,各质量浓度SAR(0.01,0.1μg/mL)对MC3T3-E1细胞均具有明显的促增殖作用(P<0.05,P<0.01);处于快速增殖的MC313-E1细胞给药处理后各组间ALP活性未见明显差异,但对于增殖晚期MC3T3-E1细胞,不同浓度SAR均可使ALP活性增高,其中1μg/mL组效应强,与对照组相比差异非常显著(P<0.01);连续给药处理细胞15 d,SAR各组矿化结节形成数量与对照组相比均有增多趋势.此外,各浓度SAR对成熟破骨细胞数量及骨吸收能力均无明显影响,但均能抑制骨髓细胞分化形成破骨细胞.结论:SAR能促进体外培养的成骨细胞的增殖与分化成熟;SAR时分化成熟的破骨细胞无明显影响,但可抑制骨髓细胞向破骨细胞的分化,从而减少破骨细胞的产生.
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知母皂苷元对谷氨酸引起的皮层神经元损伤的保护作用研究
目的 观察知母皂苷元(Sarsasapogenin,SAR)对谷氨酸引起的皮层神经元损伤的保护作用.方法大鼠乳鼠大脑皮层神经元,培养7 d后用于实验.倒置相差显微镜观察神经元树突生长发育情况;用MTT法测定细胞活力;Hoechst33258核染色观察细胞凋亡的形态学改变; Western印迹法检测神经元SYP、caspase-3、钙蛋白酶Ⅰ蛋白表达水平.结果 形态学观察结果显示谷氨酸可明显抑制神经元树突的生长发育,表现为神经元树突总长度明显降低、一级树突数目明显减少、大分支级数明显减少及胞体面积缩小.SAR (10、30、100 μmol·L-1)可明显抑制谷氨酸对神经元树突生长发育的抑制作用,并呈明显浓度依赖.MTT和Hoechst33258核染色结果显示谷氨酸可降低神经元细胞活力及增加神经元细胞凋亡百分比.SAR(10、30、100 μmol·L-1)能明显对抗谷氨酸引起的神经元细胞活力降低及细胞凋亡百分比增加.Western印迹结果显示谷氨酸可明显降低SYP蛋白表达水平及增加活性caspase-3、钙蛋白酶Ⅰ蛋白表达水平.SAR (10、30、100 μmol·L-1)可明显对抗谷氨酸引起SYP蛋白表达降低及活性caspase-3、钙蛋白酶Ⅰ蛋白表达增加.结论 知母皂苷元能够明显对抗谷氨酸引起的皮层神经元损伤作用.
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知母皂苷元对高糖引起的体外培养大鼠海马神经元损伤的保护作用
目的 探讨知母皂苷元(sarsasapogenin,Sar)对高糖引起的海马神经元损伤是否有保护作用.方法选用出生0~24 h Sprague-Dawley(SD)大鼠乳鼠,取海马,进行海马神经元体外培养,培养7 d用于实验.实验分为正常对照组、高糖组、高糖+Sar(10、30、100 μmol·L-1)组;对照组:加入等量含0.1% DMSO培养基;高糖处理组:分别加入葡萄糖(30、50、100 mmol·L-1)作用48 h;高糖+Sar (10、30、100 μmol·L-1)组:先加入不同浓度Sar(10、30、100 μmol·L-1)作用1 h,然后加入葡萄糖(50 mmol·L-1)作用48 h;应用MTT方法观察细胞活力,免疫荧光和Western免疫印迹方法观察神经元突触素表达的改变.应用Hoechst 33258 核染色检测神经元凋亡.应用Western免疫印迹方法观察caspase-3和多聚ADP核糖聚合酶(PARP)蛋白表达改变.结果加入葡萄糖(30、50、100 mmol·L-1)作用48 h可使培养神经元细胞活力明显降低,神经元突触素蛋白表达明显降低.另外高糖也可引起神经元凋亡细胞百分比和活性caspase-3、PARP蛋白表达水平也较对照组明显提高.在加入高糖前加入不同浓度Sar (10、30、100 μmol·L-1)可明显对抗高糖引起的这些变化.培养海马神经元突触素蛋白表达较高糖组(50 mmol·L-1)明显增加,神经元凋亡细胞百分比和活性caspase-3、PARP蛋白表达水平也较高糖组明显降低.结论 Sar对高糖引起的海马神经元损伤具有明显的保护作用.
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知母皂苷元对体外培养皮层神经元树突发育的影响及信号转导机制
目的 探讨知母皂苷元(Sarsasapogenin,SAR)对大脑皮层神经元树突发育的促进作用及其信号转导机制.方法 选用出生0～24 h的Sprague-Dawley(SD)大鼠乳鼠,取皮层神经元进行体外细胞培养,4 d后用于实验.倒置相差显微镜测量培养神经元树突分支总长度(TDBL)、一级树突数目(PDN)、大分支级数(MBO)和神经元胞体面积.Western blot法观察神经元p-PDK1、p-Akt473及p-mTOR蛋白表达.结果 形态学观察结果 显示 SAR (10、30、100 μmol·L-1)可明显促进树突发育,表现为树突分支总长度增加、一级树突数目增多、大分支级数增大及胞体面积增大,并呈明显浓度依赖.SAR 30+LY组、SAR 30+TCBN组、SAR 30+Rapa组的神经元树突总长度、一级树突数目、大分支级数及胞体面积较SAR30 μmol·L-1组明显降低.Western blot结果 显示SAR 30也可明显增加p-PDK1、p-Akt473及p-mTOR蛋白表达水平.SAR 30+LY组明显降低神经元p-PDK1、p-Akt473及p-mTOR的蛋白表达水平.SAR 30+TCBN组明显降低神经元p-Akt473及p-mTOR的蛋白表达水平.SAR 30+Rapa组明显降低神经元p-mTOR的蛋白表达水平.结论 SAR对体外培养皮层神经元树突的发育有促进作用,这种作用可能与PI3K/Akt /mTOR信号转导通路有关.
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三种甾体皂苷元对心肌细胞M受体的影响
目的观察3种甾体皂苷元对大鼠心肌细胞自然减少的M胆碱受体的调节作用.方法培养大鼠原代心肌细胞,观察其M-胆碱受体数量随培养时间变化情况;知母皂苷元(ZMS),其C-25 甲基立体异构体(XMS)和薯蓣皂苷元(DIO)的终浓度分别为10-7,10-6,10-5 mol·L-1,培养d 12开始给药,连续4 d.放射配基结合分析M受体的数量.结果心肌细胞M受体数时相曲线显示,培养心肌细胞M受体数在培养时间的d 10开始下降, 到d 16达低水平.放射配基结合分析表明 DIO未呈现M受体上调作用; ZMS 和XMS均显示明显的对M受体的上调作用,并且呈现浓度依赖性.XMS的作用强度比ZMS更强,即XMS在浓度为10-7,10-6,10-5 mol·L-1时都显示对M受体显著的上调作用(P<0.05,P<0.01,P<0.01), 而ZMS 仅在浓度为10-5 mol·L-1时方呈现明显的上调作用(P<0.01).结论滋阴中药知母有效成分知母皂苷元立体构型R型在低浓度时呈现与高浓度的S构型同分异构体相近的M受体上调作用.
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知母皂苷元及其异构体对老年大鼠学习记忆和脑内M1受体密度的影响
目的观察知母皂苷元(ZMS)及其异构体(ZMR)对老年大鼠学习记忆和脑内M1受体密度的作用.方法选择24 mon龄SD老年大鼠,将动物分为老年对照组、ZMS组和ZMR组,并以3～4 mon龄青年大鼠作为正常对照,用迷宫法测定学习记忆能力,采用放射配基结合分析法测定脑内M1受体密度.结果用药组大鼠连续口服ZMS和ZMR40 d后,与老年对照组比较,其学习记忆能力明显增强,脑内M1受体密度升高.结论知母皂苷元及其异构体对老年性痴呆的胆碱能系统功能渐进性退化有一定的预防和治疗作用.
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知母皂苷元对拟痴呆大鼠β-淀粉样肽沉积及胆碱能系统功能的影响
目的观察知母皂苷元(ZMS)对拟痴呆大鼠模型脑内β-淀粉样肽沉积及胆碱能系统功能的作用.方法单侧基底核内联合注射β-淀粉样肽25-35片段(β-AP25-35)和兴奋性氨基酸建立大鼠拟痴呆模型,然后将模型动物分为假手术组37、模型组和ZMS组,采用免疫组织化学方法和图像分析法测定β-AP25-35 沉积斑块的面积.用避暗法及跳台法测定动物的学习记忆功能,用放射配基结合分析法分别测定脑胆碱乙酰转移酶(ChAT)活性和M受体密度.结果一次性脑内联合注射β-AP+IBO后,模型大鼠脑内有明显的β-AP斑块沉积,而模型大鼠喂服ZMS 60 d后,能有效地减少β-AP沉积的面积,同时ZMS能明显改善模型动物的学习记忆功能,并提高模型动物脑内ChAT活性和 M受体密度.结论 ZMS可能对脑内β-AP的沉积有一定的清除作用,并对AD低下的胆碱能系统功能有一定的改善和治疗作用.
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知母皂苷及其苷元对动物模型β肾上腺素受体的调整作用
目的:观察知母提取物知母皂苷(TIM)及其苷元(SAR)对动物模型病理性升高的β肾上腺素受体的调整作用,同时观察SAR对家兔氢化可的松模型血清皮质醇含量以及正常小鼠和甲亢大鼠糖皮质激素受体密度的影响,旨在探讨两种提取物调整β肾上腺素受体的调整作用及其机制.方法:(1) 观察TIM对甲亢大鼠模型脑组织β肾上腺素受体的调整作用;(2) 观察SAR对家兔氢考模型外周淋巴细胞β受体的调整作用;(3) 观察SAR对家兔氢考模型血清皮质醇含量的影响;(4) 观察SAR对正常小鼠和甲亢大鼠糖皮质激素受体密度的影响;(5) 用放射配基结合分析法检测动物组织细胞β受体和糖皮质激素受体数目(Rt值);(6) 用放射免疫分析法测定血清皮质醇含量.结果:氢化可的松和甲状腺素可以分别使兔外周淋巴细胞和大鼠脑组织β受体数目升高;SAR和TIM可使上述动物病理性升高的β受体密度趋于正常;SAR不影响兔肝脏糖皮质激素受体密度和血清皮质醇(Cor)含量.结论:TIM和SAR对动物模型病理性升高的β受体的具有调整作用,这种作用与糖皮质激素及其受体无关.
