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首批肠道病毒71型人免疫球蛋白国家标准品的研制
目的 制备首批肠道病毒71型免疫球蛋白国家标准品,用于肠道病毒71型特异性免疫球蛋白产品效价测定.方法 选择国内经批签发检验合格的静注人免疫球蛋白产品以及高效价肠道病毒71型人免疫球蛋白作为原料进行合并,分装冻干后并按规定对标准品的水分含量、分装精度、无菌检查和稳定性进行考察.在5家实验室按微量细胞病变法进行协作标定,以肠道病毒71型中和抗体滴度的倒数作为中和效价,单位定义为u.结果 5家实验室共进行了63次协作标定,结果均经LOG转换后进行计算,实验室内几何变异系数GCV范围为1.5％～4.1％,实验室间几何变异系数GCV平均值为3.1％,效价几何平均值为327 U.为以后使用和计算方便,该批次标准品赋值为330 U.该标准品160 d加速破坏实验和22 m长期稳定性考察显示效价稳定无下降趋势,12 m测定不同温度点的单体加二聚体(HPLC-SEC法)含量大于98.0％,有效成分稳定.该标准品的水分含量为0.6％,分装精度为0.56％,无菌检查合格.结论 该批肠道病毒71型人免疫球蛋白标准品各项检测指标符合要求,可以作为国家标准品发放用于肠道病毒71型特异性免疫球蛋白的效价测定.
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人巨细胞病毒培养条件的优化及快速病毒滴度检测方法的建立
目的 优化人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)的培养条件,并建立一种快速检测HCMV滴度的方法.方法 以人胚肺二倍体细胞(MRC-5)为病毒传代和滴度测定用细胞,对病毒接种量、培养温度、保护剂种类等条件进行优化.将本实验室建立的快速微量中和试验-感染细胞核染色法用于病毒滴度检测,并与蚀斑形成法及微量细胞病变法进行比较,采用Behrens-Karher法计算病毒滴度.结果 HCMV接种MRC-5细胞后在37℃培养可出现明显病变;MOI为1.0时,病毒滴度基本达到平台;病毒收获时加入1％人血白蛋白或10％ FBS保护剂可维持病毒滴度稳定.同一病毒液经蚀斑形成法检测病毒滴度为5.707 lgPFU/ml,微量细胞病变法和感染细胞核染色法检测病毒滴度分别为5.633和5.667 lgCCID50/ml,3种方法的检测结果差异无统计学意义(P＞0.05).结论 HCMV接种MRC-5的佳培养条件为:病毒接种量1.0 MOI,在37℃培养,加入1％人血白蛋白或10％ FBS作为保护剂.建立的感染细胞核染色法可用于HCMV滴度的快速测定,为抗病毒物质的开发及效果评价提供了一种新的技术手段.
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脑心肌炎病毒蚀斑纯化及滴度测定方法的建立
目的 建立脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)蚀斑纯化及滴度测定方法.方法 将EMCV系列稀释后接种至单层Veto细胞,覆盖甲基纤维素,出斑后挑取蚀斑进行扩增,收获病毒液.选取5个EMCV原液样品感染Veto细胞进行蚀斑滴度测定,经结晶紫染色计数蚀斑,计算病毒滴度.重复测定5次,验证蚀斑法的精密性,并与微量细胞病变法进行比较.结果 EMCV感染Veto细胞后,约48 h出现边缘整齐直径为0.5～ 1.5mm的蚀斑,经结晶紫染色后,可见清晰透明空斑,边缘清晰.5个EMCV原液样品经蚀斑法测得的病毒滴度在3.16×106～1×107 PFU/ml之间,变异系数为0.88％～2.07％;经微量细胞病变法测得的病毒滴度均大于3.16×107 PFU／ml,变异系数为1.63％～2.90％,表明蚀斑法精密性更好;两种方法经直线回归分析,具有线性相关性(r=0.810,P=0.097).结论 建立了简便直观的EMCV蚀斑纯化方法及精密性良好的蚀斑滴度测定方法,为EMCV的生物学特性及疫苗研究奠定了基础.
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微量细胞病变法检测原料血浆中肠道病毒71型中和抗体水平
目的 应用微量细胞病变法检测原料血浆中肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)中和抗体水平,以确定可供EV71免疫球蛋白生产用的原料血浆筛选标准.方法 建立检测EV71中和抗体效价的微量细胞病变法,检测3批质控血浆,验证该方法的重复性;并对1 238份原料血浆进行检测.结果 微量细胞病变法检测高(1:400)、低(1:50)效价质控血浆EV71中和抗体效价的变异系数分别为22.7%和27.3%;约40%的原料血浆中和抗体效价＜1:8,约60%的中和抗体效价≥1:8.结论 微量细胞病变法可用于原料血浆中EV71中和抗体的检测,约23%的献浆员的EV71中和抗体效价达1:32以上,可用于EV71免疫球蛋白的生产.
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静注人免疫球蛋白制剂抗巨细胞病毒中和抗体效价的筛查
目的 筛查国内、外静注人免疫球蛋白(human intravenous immunoglobulin,IVIG)和静注巨细胞病毒人免疫球蛋白(human intravenous cytomegalovirus immunoglobulin,CMV-IVIG)制品抗CMV中和抗体效价.方法 采用微量细胞病变法检测国内、外IVIG制品及CMV-IVIG抗CMV中和抗体效价,并进行比较.结果 国外CMV-IVIG制品Cytogam(3 648 U/g IgG)和Cytotect(3 104 U/g IgG)抗CMV中和抗体效价分别是IVIG制品Privigen(1 048 U/gIgG)和Intratect(980 U/g IgG)的3.5和3.2倍;国内CMV-IVIG制品抗CMV中和抗体平均效价(7 195 U/g IgG)是国内13家企业19批IVIG制品(1 836 U/g IgG)的3.9倍;国内IVIG制品抗CMV中和抗体平均效价是国外IVIG制品Privigen和Intratect的1.8和1.9倍,国内CMV-IVIG制品抗CMV中和抗体平均效价是国外CMV-IVIG制品Cytogam和Cytotect的2.0和2.3倍.结论 国内、外的CMV-IVIG制品抗CMV中和抗体效价均为相应IVIG制品3倍以上,采用微量细胞病变法筛查血浆用于制备CMV-IVIG具有可行性,为CMV相关疾病的被动免疫制剂的制备提供了实验依据.
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上海某区儿童血清轮状病毒LLR型疫苗株的免疫水平
[目的]了解2012年上海部分0～5周岁儿童的血清轮状病毒LLR型中和抗体水平及不同年龄段儿童轮状病毒感染的情况,为疫苗的研究提供科学数据. [方法]在2012年6--8月上海市静安区儿保门诊部就诊的儿童中,筛选无发热、无轮状病毒感染疑似症状的健康儿童血清标本210份,采用微量中和试验方法检测儿童血清对轮状病毒LLR型疫苗株的中和抗体水平,并对检测结果进行统计学分析. [结果]210份0～5周岁儿童血清中,轮状病毒LLR型中和抗体阳性率为27.1％,中和抗体几何平均滴度(GMT)为1∶35.36;0～6个月婴儿血清中和抗体阳性率为16.0％,GMT为1∶28.72;7～11个月儿童血清中和抗体阳性率为2.5％,GMT为1∶25.88.1～2周岁儿童的中和抗体阳性率为20.0％,GMT为1∶30.78,2～3周岁儿童的中和抗体阳性率为20.0％,GMT为1∶32.99,该两年龄组(段)间差异无统计学意义.3～4周岁儿童的中和抗体阳性率为56.67％,GMT为1∶54.84,4～5周岁儿童的中和抗体阳性率为63.33％,GMT为1∶44.55,此两年龄组(段)儿童的阳性率和GMT均显著高于3周岁以下各年龄组,此两组间阳性率差异无统计学意义.[结论]0～3周岁儿童中和抗体水平较低,特别是7～11个月年龄组为低,提示可能为轮状病毒感染的高危儿童群体.
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兔角膜基质细胞培养及对病毒敏感性的实验研究
目的研究体外培养兔角膜基质细胞对病毒的敏感性.方法采用微量细胞病变法,观察体外培养的兔角膜基质细胞对单纯疱疹病毒Ⅰ、Ⅱ型(herpes simplex virus Ⅰ、Ⅱ,HSV-Ⅰ、Ⅱ)、腺病毒3型(adenovirus type 3,Ad3)、滤疱性口腔炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)等4种病毒的敏感性.结果病毒接种于兔角膜基质细胞48h,HSV-Ⅰ和HSV-Ⅱ效价(TCID50)分别为64×10-3 、128×10-3,VSV效价(TCID50)为10-2 ,Ad3不引起细胞病变.结论兔角膜基质细胞对HSV-1、HSV-2均敏感,对VSV、Ad3不敏感.
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人骨髓基质细胞的长期培养及其对病毒的敏感性
为了长期培养人骨髓基质细胞和研究其对病毒的敏感性,我们采用静置贴壁培养法, 体外长期培养了胎儿、儿童和成人骨髓基质细胞,并将传至5代以上的肌样骨髓基质细胞采用微量细胞病变(CPE)法,开展了对5种病毒的敏感性试验.结果表明,人骨髓基质肌样细胞对滤泡性口腔炎病毒,脊髓灰质炎病毒、I型和Ⅱ型单纯疱疹病毒均敏感,能产生明显的CPE ,其效价(TCID50)可达10-3～10-4,其中胎儿骨髓基质肌样细胞对病毒敏感性至少比儿童高2倍,比成人高4倍,即胎儿＞儿童＞成人,但对B3型柯萨奇病毒均不敏感.我们的研究结果不仅可为人骨髓基质细胞体外长期培养提供了确实可行的简便方法, 而且为该细胞对病毒的敏感性提供了实验依据,并为该细胞的利用开辟了新的应用前景.
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微量细胞病变法检测人巨细胞病毒中和抗体效价方法的建立
目的 建立人巨细胞病毒(HCMV)中和抗体效价微量细胞病变检测方法.方法 确定检测HCMV中和抗体效价的微量细胞病变法的细胞密度、病毒剂量和培养时间,采用K(a)rber法计算样品中和效价,并对该方法做线性、准确性、精密度和耐用性方法学验证.结果 感染HCMV的MRC-5细胞出现典型细胞病变,该方法准确性好,线性回归系数均＞0.99;重复性验证:变异系数为18.4％-20.6％;中间精密度验证:变异系数为23.2％-27.0％;不同细胞密度、病毒剂量与中和反应时间范围亦显示该方法耐用性良好.结论 所建立的HCMV中和抗体效价微量细胞病变法具有较好的线性、准确性、精密度及耐用性,可用于HCMV人免疫球蛋白中和抗体效价的检测.
