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StarD7与Wnt/β-catenin信号通路对Annexin 5刺激大鼠Leydig细胞睾酮分泌的影响
目的:研究StarD7以及Wnt/β-catenin信号通路促进睾酮合成的内在机制,探索睾酮合成的调控新途径.方法:用l nmol/L的Annexin 5处理大鼠原代Leydig细胞24 h,化学发光法检测睾酮含量,利用RT-PCR和Westernblot方法分析StarD7和β-catenin在mRNA和蛋白水平上的表达变化,并利用免疫荧光法对β-catenin进行定位.结果:在Annexin 5的刺激作用下,与对照组相比,睾酮合成水平明显增加了176％[(7.83 +0.32)vs.(21.6±1.1),P＜0.05];在Annexin 5作用下,与对照组相比,StarD7在mRNA水平表达增加55％[(1.12 +0.08)vs.(1.74±0.11),P＜0.05],β-catenin表达增加48％[(1.15±0.08)vs.(1.70+0.05),P＜0.05].在蛋白水平上,与对照组相比,StarD7增加42％[(1.06±0.09)vs.(1.51±0.07,P＜0.05)],β-catenin增加55％[(1.02±0.01)vs.(1.58±0.02),P＜0.05],此外在Annexin 5作用下,β-catenin有入核积聚的趋势.结论:在Annexin 5作用下,StarD7和β-catenin的表达均有显著增加,且β-catenin有入核积聚的趋势,提示StarD7和β-catenin对Annexin 5刺激Leydig细胞睾酮的合成均有调控作用,该过程可能是通过激活Wnt/β-catenin信号通路,从而促进StarD7表达上升,终导致睾酮合成增加.
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膜联蛋白5对大鼠睾丸间质细胞中类固醇急性调节蛋白和睾酮合成相关酶表达的影响
目的:研究膜联蛋白5(annexin 5)对大鼠睾丸间质细胞(Leydig细胞)睾酮合成相关蛋白和酶表达的影响.方法:原代培养大鼠睾丸间质细胞24 h后,用10-9 mol/L的annexin 5处理间质细胞12 h和24 h,分别提取细胞总RNA和总蛋白;反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测类固醇急性调节蛋白(steroidogenic acute regulatory,StAR)、胆固醇侧链裂解酶(P450scc)、3β-羟基类固醇脱氧酶(3β-hydroxysteroid dehydrogenase,3β-HSD)、17α-羟化酶(17α-hydroxylase,CYP17A)、17β-羟基类固醇脱氢酶X型(17β-HSD10)mRNA表达的改变,并用蛋白免疫印迹方法(Western blotting)检测蛋白表达水平的变化.结果:与对照组相比,在mRNA水平上,annexin 5处理细胞12 h后,只有17β-HSD10的表达升高了26%(P＜0.05),其他差异均无统计学意义,而处理24 h后,StAR、P450scc和3β-HSD 的表达分别升高55%、69%和59%(P＜0.05),17β-HSD10升高了104%(P＜0.01),17α-hydroxylase表达则无显著差异;在蛋白水平上,annexin 5处理细胞12 h后,17β-HSD的表达升高了39%(P＜0.05),而处理24 h后发现,除StAR表达无显著变化外,P450scc、3β-HSD和17β-HSD的表达分别升高了35%、88%(P＜0.05)和47%(P＜0.01).结论:Annexin 5对睾酮合成具有调节作用,这种作用是通过在基因水平和蛋白水平上影响P450scc、3β-HSD和17β-HSD的表达而实现的.
关键词： 膜联蛋白5 睾丸间质细胞 胆固醇侧链断裂酶 17-羟甾类脱氢酶类 -
Annexin5对雄性SD大鼠应激损伤的保护作用
目的 研究膜联蛋白5(annexin 5,A5)对坐骨神经选择性损伤引起的慢性疼痛应激致雄性SD大鼠生殖损伤的保护作用.方法 32只雄性SD大鼠随机分为4组,分别建立对照组、假手术组、手术组和手术+A5组模型.手术+A5组于术后第2天腹腔注射15μg/kg剂量的A5,其他实验组腹腔注射等量的pH 8.0 Tris-HCl,每日1次,连续21 d.分别测各组SD大鼠体重、称重睾丸和附睾,计算其脏器系数,并对附睾尾进行精子计数.HE染色观察睾丸组织结构变化.用化学发光法检测各组大鼠血清中睾酮浓度.结果 手术组大鼠与对照组相比,睾丸系数、附睾系数以及精子相对计数均降低(P＜0.05)；睾酮水平下降显著[(5.10±2.61) vs (22.40±4.30) mmol/L,P＜0.0l)]；病理切片见睾丸生精细胞与腔内精子数量明显减少.假手术组大鼠与对照组比,上述指标均无统计学差异.手术+A5组与手术组比,精子相对计数与睾酮含量[(19.67±2.02)vs(5.10±2.61) mmol/L,P＜0.01]均显著提高,其他参数均有不同程度的恢复,睾丸生精细胞与腔内精子数量减少程度显著恢复.结论 A5对慢性疼痛应激引起的生殖损伤具有一定的保护作用.
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Annexin5对人精子线粒体功能的影响
目的 观察膜联蛋白5(annexin 5)对人精子线粒体功能的影响.方法 收集38例少弱精症患者精液标本.精子与annexin 5共温育,用罗丹明(Rh123)和碘化吡啶(PI)染色并用流式细胞术检测人精子线粒体功能.结果 添加annexin 5组与对照组相比,线粒体功能良好的活精子百分率[(38.77±9.20)%vs(26.12±10.09)%,P<0.05]和线粒体荧光值[(509.72±45.02)vs(452.88±39.39),P<0.05]均有显著性升高.结论 体外添加annexin 5能增强精子线粒体的活性.
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大鼠睾丸间质细胞中NO供体调控睾酮分泌的机制
目的 研究一氧化氮(NO)供体(硝普钠,SNP)对大鼠睾丸间质细胞分泌睾酮的影响及其机制.方法 大鼠睾丸间质细胞原代培养12 h后,用不同浓度的SNP(0,10-8,10-8,10-4mol/L)分别处理4、8、12 h,用化学发光法检测细胞上清睾酮(T)水平的变化;western blot法分析间质细胞内3β-HSD(3β-羟基类固醇脱氢酶)和annexin 5(膜联蛋白5)的变化.结果 10-4mol/L的SNP处理间质细胞8 h后,睾酮水平较对照组上升23%(P<0.05);10-6mol/L的SNP处理12 h后,睾酮水平较对照组上升28%(P<0.05),10-4 mol/L的SNP处理12 h,较对照组升高37%(P<0.05).western blot结果显示,SNP的刺激对3β-HSD表达无显著影响.不同浓度SNP刺激间质细胞4 h和8 h后,annexin 5表达量与对照组比较无显著差异(P>0.05);10-6mol/L的SNP刺激12 h后,annexin 5表达量达到高水平,较对照组升高55%(P<0.05);10-4mol/L的SNP处理12 h,armexin 5表达量较对照组升高48%(P<0.05).结论 SNP在低浓度范围内促进大鼠睾丸间质细胞分泌睾酮,且睾酮的分泌时SNP具有时阃和剂量的依赖性;SNP刺激睾酮分泌的过程并非通过3β-HSD介导,但可能与armexin 5表达有关.
关键词： 一氧化氮 硝普钠 睾丸间质细胞 3β-羟基类固醇脱氢酶 膜联蛋白5 -
急性疼痛应激对SD大鼠胃及颌下腺组织annexin 5表达的影响
目的 研究在福尔马林致炎的急性疼痛应激状态下SD大鼠胃及颌下腺组织膜联蛋白5(annexin 5)表达的影响.方法 单侧后足底皮下注射0.2 ml 5%福尔马林溶液,建立SD大鼠的急性疼痛应激模型,对照组注射等量的生理盐水,分别取对照组和应激组SD大鼠胃及颌下腺组织通过western blot分析急性应激状态下大鼠胃及颌下腺组织annexin 5表达的变化.结果 在急性疼痛应激状态下,1 h和72 h组胃组织annexin 5表达水平与对照组相比均无显著性差异(P>0.05),而6 h和24h组annegin 5表达水平显著升高(P<0.01);1 h和24 h组颌下腺组织annexin 5表达水平与对照组相比均无显著性差异(P>0.05),而6 h和72 h组显著升高(P<0.1);结论 annexin 5参与了胃及颌下腺对急性疼痛应激的反应,急性疼痛可能通过annexin 5影响胃及颌下腺的功能.
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膜联蛋白5刺激大鼠Leydig细胞增殖过程中RhoA、Rock Ⅰ的表达
目的 研究RhoA、Rock Ⅰ促进大鼠Leydig细胞增殖的机制,探讨膜联蛋白5调控Leydig细胞增殖的新途径.方法 用1 nmol/L膜联蛋白5处理原代培养大鼠Leydig细胞12、24、48 h后,用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期,western blot检测RhoA和Rock Ⅰ的蛋白质表达情况.结果 MTT法结果显示,1 nmol/L膜联蛋白5呈显著的时间依赖的促进Leydig细胞增殖作用,且24h组细胞增殖能力与对照组差异为显著(0.251 ±0.019 vs 0.207±0.009,t=4.380,P＜0.01);流式细胞分析发现,1 nmol/L膜联蛋白5作用于Leydig细胞,以作用24 h时对细胞周期的影响为显著,可使G2+M期比例比对照组升高(12.24±0.84 vs 7.79±1.15,t =5.407),G0/G1期比例下降(67.61±0.37 vs 74.49±0.73,t=-14.64),P均＜0.01;western bolt结果表明,膜联蛋白5作用12、24、48 h后Leydig细胞RhoA表达结果分别为1.39±0.29、2.21±0.38、1.46±0.19,与0h组结果0.89±0.41比较,均有升高(t=2.028,P＜0.05;t=4.736,P＜0.01;t =2.550,P＜0.05);膜联蛋白5作用24、48 h后Leydig细胞Rock Ⅰ表达结果分别为1.14±0.18、1.03±0.17,与0h组结果0.72±0.22比较均升高(=2.944,P＜0.01;=2.246,P＜0.05).结论 RhoA、Rock Ⅰ可能参与膜联蛋白5促进细胞周期G0/G1进程,终促进Leydig细胞的增殖.
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大鼠膜联蛋白5的重组表达及其对人精子体外运动功能的影响
目的:先前研究发现促性腺激素释放激素(GnRH)激动剂对大鼠睾丸间质细胞中膜联蛋白5(annexin 5)的翻译和转录水平都有一定的影响,推测annexin 5可能是睾酮分泌调节中的一个信号分子.为研究annexin 5 在雄性生殖调节中的作用,本研究拟获得具有活性的大鼠annexin 5重组蛋白,并观察其对人精子运动功能的影响.方法:化学合成法合成大鼠 annexin 5的编码基因序列,将该基因插入组氨酸标签(HIS)融合表达载体pET28a中,在17启动子控制下,通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达HIS融合蛋白;以亲和层析法纯化表达融合蛋白并用活化部分凝血激酶时间(APTT)交叉试验法验证该蛋白的抗凝血活性.15例供精者的精液标本一式2份,1份加重组蛋白annexin 5(终浓度为10-8 mol/L),1份做对照,分别处理20和60 min,用计算机辅助精液分析系统(CASA)分析精子活力、活动率;处理20 min后,做精子爬高试验. 结果:合成的目的基因产物长度为974 bp,插入序列与annexin 5的序列完全一致.在IPTG诱导下,BL21(DE3)重组菌高效表达出相对分子质量为36 000的融合蛋白,经纯化获得95%纯度的融合蛋白,纯化蛋白具有很强的抗凝血活性.Annexin 5处理20 min后精子活动率提高了21%(P<0.05),活力提高了40%(P<0.01),而处理60 min后精子活力、活动率与对照组比较均无显著性差异;精子爬高高度与对照组比较具有极显著差异[(37.84±6.35)mm vs (49.5±12.27)mm,P<0.01]. 结论:成功构建了大鼠annexin 5重组表达载体并在大肠埃希菌中高效表达annexin 5蛋白,且该蛋白体外处理精子20 min时提高精子的运动能力.
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膜联蛋白5对雄性SD大鼠睾酮合成相关蛋白和酶表达的影响
目的 研究注射膜联蛋白5后雄性SD大鼠睾丸类固醇急性调节蛋白(Steroidogenic acute regulatory protein,StAR)、胆固醇侧链裂解酶(P450 cholesterol side-chain cleavage enzyme,P450scc)和3β-羟类固醇脱氢酶(3 beta-hydroxysteroid dehydrogenase,3β-HSD)表达的改变,初步探讨膜联蛋白5影响睾酮分泌的机制.方法 将20只SD大鼠随机分为对照组和实验组,实验组又分为7.5μg/kg组、15μg/kg组和30μg/kg组,每组5只.对照组大鼠腹腔注射等量的pH 8.0Tris-HCl,实验组腹腔注射不同剂量的膜联蛋白5,1次/d,连续20d.用RT-PCR方法分别检测对照组和各实验组SD大鼠睾丸组织中睾酮合成相关的StAR、P450scc和3β-HSD mRNA的表达变化,并用Western blot方法检测以上3种物质蛋白质水平的变化.结果 与对照组相比,在mRNA水平上,7.5μg/kg组和15μg/kg组大鼠睾丸组织P450scc mRNA表达分别增加了25.9%[(0.68±0.04) vs (0.54±0.03),P<0.01]和27.8%[(0.69±0.04) vs (0.54±0.03),P<0.01];3β-HSD mRNA表达分别升高了32.9%[(1.05±0.07) vs (0.79±0.10),P<0.01]和53.2%[(1.21±0.07) vs (0.79±0.10),P<0.01];而30μg/kg组表达差异无统计学意义;在蛋白水平上,15μg/kg组大鼠睾丸组织P450scc蛋白表达提高了34.2%[(0.37±0.04) vs (0.28±0.02),P<0.01],7.5μg/kg组和15μg/kg组的3β-HSD表达也分别增加了14.7%[(1.53±0.10) vs (1.34±0.05),P<0.01]和24.4%[(1.67±0.14) vs (1.34±0.05),P<0.01];而StAR的表达无论在转录水平还是在蛋白水平上,较对照组差异均无统计学意义.结论 膜联蛋白5可通过调节P450scc与3β-HSD的表达来调节睾酮合成.
关键词： 膜联蛋白5 类固醇急性调节蛋白 胆固醇侧链裂解酶 3β-羟类固醇脱氢酶 -
膜联蛋白5对大鼠睾丸间质细胞睾酮分泌及3β-羟基类固醇脱氢酶表达的影响
目的 先前研究发现促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone, GnRH)刺激Leydig细胞后,膜联蛋白5(annexin 5)及睾酮水平同时增加,推测annexin 5和睾酮之间可能存在某种内在的联系,3β-羟基类固醇脱氢酶(3β-HSD)是间质细胞的标记酶.文中旨在研究annexin 5对大鼠睾丸间质细胞睾酮分泌及3β-HSD表达的影响. 方法原代培养大鼠睾丸间质细胞,用不同浓度的annexin 5(0、10-10、10-9、10-8mol/L)处理间质细胞24h和用10-9mol/L的annexin 5处理细胞不同时间(6、12、24、36h),收集培养液,用化学发光法测定培养液中的睾酮含量;Western blotting方法分析睾丸间质细胞中3β-HSD的表达变化. 结果 不同浓度的annexin 5处理间质细胞24h后,与对照组比较,终浓度为10-10mol/L和10-9mol/L时,睾酮水平分别升高了18%[(14.38±0.30)nmol/L vs (12.12±0.74)nmol/L](P<0.01)和26%[(15.25±0.47)nmol/L vs (12.12±0.74)nmol/L](P<0.01);浓度为10-8mol/L时,睾酮水平虽也有升高趋势,但无显著性差异;而Western blotting结果显示,浓度为10-9mol/L时,3β-HSD表达量升高了63%(2.19±1.00 vs 1.34±0.19,P<0.05),浓度为10-10mol/L和10-8mol/L时,3β-HSD表达量无显著性差异;睾酮分泌与3β-HSD的表达呈显著正相关(r=0.430,P<0.05).10-9mol/L的annexin 5处理细胞不同时间,与对照组相比,6h和12h后睾酮的分泌虽有升高,但无统计学意义(P＞0.05);24h后睾酮的分泌量显著升高了18%[(12.59±0.41)nmol/L vs (10.70±0.09)nmol/L](P<0.01);而处理36h后,睾酮分泌量下降了21%[(14.44±1.65)nmol/L vs (17.46±0.31)nmol/L](P<0.01). 结论 在大鼠睾丸间质细胞中,annexin 5对睾酮分泌具有调节功能且呈剂量和时间依赖性;3β-HSD是该调节过程中的关键酶之一.
关键词： 膜联蛋白5 间质细胞 睾酮 3β-羟基类固醇脱氢酶 -
促性腺激素释放激素类似物对大鼠睾丸间质细胞膜联蛋白5和3β-羟类固醇脱氢酶mRNA表达的影响
目的:观察促性腺激素释放激素(GnRH)类似物对大鼠睾丸间质细胞annexin 5和3β-HSD mRNA表达的影响. 方法:原代培养大鼠睾丸间质细胞48h后,分别用不同终浓度的GnRH激动剂(GnRH-agonist, GnRHa)(10-5mol/L、10-6 mol/L、10-7 mol/L)和GnRH 拮抗剂(GnRH-antagonists, GnRHant)(10-6 mol/L、10-7 mol/L、10-8 mol/L)处理细胞,提取细胞总RNA,反转录,设计特异性引物和Tagman探针,荧光定量PCR检测膜联蛋白5(annexin 5)和3β-羟类固醇脱氢酶(3β-HSD) mRNA表达的改变. 结果:荧光定量PCR结果显示,与未加GnRH类似物的对照组相比,当GnRHa的终浓度为10-5mol/L、10-6mol/L时,实验组大鼠睾丸间质细胞annexin 5 mRNA 分别升高了38.89%和35.29%,均具有统计学意义(P<0.05);当GnRHa的浓度为10-5mol/L时,3β-HSD mRNA也显著升高了46.43%(P<0.01).同样,与对照组相比,当GnRHant的浓度为10-6mol/L时,实验组大鼠睾丸间质细胞annexin 5 mRNA下降了45.45% (p<0.05),当GnRHant的浓度为10-6mol/L,10-7mol/L时,实验组大鼠睾丸间质细胞3β-HSD mRNA也分别显著地降低了63.64%(P<0.01)和50%(P<0.05),其余各组与对照组相比,差异无统计学意义. 结论:GnRH类似物能够调控大鼠睾丸间质细胞annexin5和3β-HSD mRNA表达,GnRH类似物可能与睾丸间质细胞上GnRH受体结合后,通过特定的生理机制,进而影响annexin5和3β-HSD mRNA表达,为揭示GnRH类似物调控间质细胞分泌睾酮的作用机制提供了一定的依据,其内在的机制还有待进一步研究.
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去颌下腺对大鼠睾丸膜联蛋白5表达的影响
目的:观察切除颌下腺对大鼠睾丸膜联蛋白5(annexin 5)表达的影响.方法:切除大鼠颌下腺,分别于术后14、28和42d处死大鼠,Western blotting和免疫组织化学分析大鼠睾丸annexin 5表达及分布的改变.结果:Western blotting结果显示,与对照组相比,切除颌下腺14d和28d后,实验组大鼠睾丸annexin 5的表达分别升高了27.5%和35.2%,具有显著性差异(P＜0.05,P＜0.01);切除颌下腺42d后,实验组大鼠睾丸annexin 5又恢复到与对照组几乎相同的水平.免疫组织化学显示,annexin 5在大鼠睾丸中的分布未见明显改变,但实验组annexin 5免疫组化显色较深,说明annexin 5的表达升高,这与Western blotting的结果基本一致.结论:颌下腺切除影响大鼠睾丸annexin 5的表达,颌下腺切除早期(14、28 d)颌下腺分泌的某些生物活性物质缺乏,而造成睾丸内annexin 5表达的升高.颌下腺切除后期(42 d),机体内因颌下腺切除而缺乏的某些物质在体内又重新得到了补偿,对睾丸annexin 5的影响消除,睾丸annexin 5的表达也恢复到正常水平.其内在具体机制尚待进一步阐明.
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Annexin A5表达与鼻咽癌分化转移的关系
目的 探讨Annexin A5表达与鼻咽癌分化和转移的关系.方法 采用免疫组织化学方法检测65例鼻咽癌、18例淋巴结转移性鼻咽癌和20例慢性鼻炎标本中Annexin A5的表达水平,并分析其表达水平与鼻咽癌临床病理特征的关系;采用Western blot检测不同分化程度和不同转移潜能NPC细胞系中Annexin A5的表达;采用siRNA技术下调5-8F细胞中Annexin A5表达后,观察其侵袭能力的变化.结果 AnnexinA5的阳性表达率在鼻咽癌、淋巴结转移鼻咽癌和对照组中分别为84.6%(55/65)、94.4%(17/18)和10.0%(2/20);淋巴结转移性鼻咽癌组高于鼻咽癌组,鼻咽癌组高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05).Annexin A5表达与组织学类型、局部转移、淋巴结转移、远处转移、临床分期和复发有关(P<0.05),而与年龄,性别无关.Annexin A5表达下调能降低NPC细胞的侵袭能力.结论 Annexin A5表达与鼻咽癌的分化和转移有关,可作为NPC分化、转移及预后的分子标志物.
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膜联蛋白5在大鼠消化器官中的细胞定位
目的:观察膜联蛋白5(Annexin 5)在大鼠部分消化器官中的细胞定位,为探讨Annexin 5在消化器官内可能发挥的生理学作用奠定基础.方法:选取健康SD大鼠,经Bouin's液固定其消化器官(胃、小肠、肝脏、胰腺)后,应用特异的兔抗Annexin 5抗血清,采用免疫组织化学方法和免疫荧光化学方法,观察Annexin 5在大鼠消化器官中的细胞定位.结果:Annexin 5在大鼠的消化器官中呈细胞特异性分布.Annexin 5在胃上皮细胞、胃底腺部分细胞、小肠绒毛杯状细胞、胆管内皮细胞和血管内皮细胞中分布较多,同时在胃和肠的黏膜层和肌层的部分细胞、小肠固有层中某些细胞、肝内皮细胞、胰腺血管内皮细胞中也有分布.结论:Annexin 5存在于大鼠消化器官执行特殊功能的一些细胞内,提示Annexin 5可能在这些细胞发挥生理功能的过程中具有特定的作用.
