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新西兰初级产业部宣布：多次复查未发现肉毒杆菌
本刊讯（记者逯文娟）新西兰初级产业部8月28日宣布，该部门组织专家在新西兰和美国的多家实验室，对恒天然集团生产的浓缩乳清蛋白重新进行了195次检测，结果表明，此前在恒天然产品中发现的细菌并非肉毒杆菌，而是与之相似的梭状芽孢杆菌（简称生孢梭菌）。
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生孢梭菌代谢产物对ICR小鼠的毒性研究
目的 研究生孢梭菌代谢产物对ICR小鼠的毒性作用.方法 将分离自浓缩乳清蛋白粉及其制品样品中的生孢梭菌分别培养在庖肉肉汤及TPGY肉汤培养基中,将过滤除菌及处理后的培养液分别经灌胃和腹腔注射给予ICR小鼠,观察其中毒及死亡情况.结果 生孢梭菌培养液及处理后的培养液经腹腔注射ICR小鼠后均对其有毒性作用,中毒症状表现为小鼠急促呼吸后猝死,死亡时间多集中在10 min内,平均为5～7 min,A-F多价抗肉毒毒素诊断血清对小鼠无保护作用.结论 生孢梭菌代谢产物中含有不同于肉毒毒素的有毒代谢产物,腹腔注射可导致ICR小鼠猝死.
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IL-12修饰的生孢梭菌抗小鼠乳腺癌作用观察
目的 基于实体瘤内部普遍存在缺氧区及生孢梭菌厌氧生长的特性,利用生孢梭菌靶向递送IL-12至肿瘤部位,观察其抗肿瘤效果及其毒副作用. 方法 利用基因工程技术将IL-12 cDNA克隆至大肠埃希菌-厌氧菌穿梭质粒pIMP1并转入生孢梭菌.用ELISA和Western blot分析其IL-12的表达;IFN-γ诱导试验测定其生物学活性;利用小鼠乳腺癌细胞EMT6制备小鼠肿瘤模型,尾静脉注射重组梭菌后观察其抗肿瘤效果及其毒性表现. 结果 ELISA和Western blot显示重组生孢梭菌可分泌IL-12,体外与小鼠脾脏细胞共同培养可以引起IFN-γ的释放.重组生孢梭菌静脉注射到荷瘤小鼠体内后,小鼠血清IFN-γ显著增高,肿瘤萎缩.实验过程中未观察到与IL-12相关的腹泻、体重减轻和死亡等毒性作用. 结论 利用重组生孢梭菌生产的IL-12具有抗小鼠乳腺肿瘤作用,且没有明显毒性.
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一例气性坏疽住院患者消毒隔离工作的探讨
气性坏疽是由各种气性坏疽杆菌引起的一种严重的急性特异性感染,病情发展迅速,如不及时处理,病人常丧失肢体,甚至死亡.气性坏疽多由产气荚膜梭菌、诺氏梭菌或败毒梭菌引起,溶组织梭菌、双酶梭菌、生孢梭菌等很少单独引起感染,常与上述致病菌一起造成混合性感染.人接触被上述致病菌污染的物品后,可通过皮肤上的破损处引起感染.
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重组大肠埃希菌-厌氧梭菌穿梭质粒pIMP1-eIL-12稳定转化生孢梭菌
目的 近些年来,以厌氧芽孢梭菌作为实体瘤基因治疗载体的研究逐渐受到关注.文中用重组人白细胞介素-12(rhIL-12)基因重组大肠埃希菌(E.coli)-厌氧梭菌穿梭质粒pIMP1,并稳定转化生孢梭菌,为增强杀伤肿瘤细胞的研究提供基础.方法 用SOE-PCR法将rhIL-12基因连到厌氧梭菌的内源性β1,4-葡聚糖酶(endo-1,4-glucanase,eglA)启动子和信号肽之后,构建融合基因eglAp-rhIL-12,将其插入pIMP1,构建重组质粒pIMP1-eIL-12;重组质粒首先在E.coli DH5α内进行鉴定,然后用电穿孔法转化生孢梭菌;利用红霉素抗性筛选阳性克隆,并提取质粒鉴定阳性克隆.结果 酶切和测序结果表明插入到pIMP1内的融合基因eglAp-rhIL-12序列及读框正确;抗生素压力筛选和20多代随机质粒提取酶切鉴定结果表明重组质粒pIMP1-eIL-12已稳定转化生孢梭菌.结论 成功获得重组质粒pIMP1-eIL-12及其生孢梭菌稳定转化株,为以后的抗肿瘤研究奠定了基础.
关键词： 大肠埃希菌-厌氧梭菌穿梭质粒 生孢梭菌 rhIL-12 pIMP1 -
hIL-12及HER2/neuECD修饰的生孢梭菌工程菌的构建及鉴定
目的 构建人IL-12(hIL-12)基因和乳腺癌靶基因HER2/neu胞外区(ECD)分别修饰的生孢梭菌工程菌,探讨其在乳腺癌基因治疗中的作用.方法 将hIL-12和HER2/neu ECD的基因分别连接到厌氧梭菌的内源性β-1,4-葡聚糖酶启动子和信号肽序列(eglAp)之后,得到融合基因eglAp-hIL-12和eglAp-HER2/neu.将融合基因插入大肠杆菌-厌氧菌穿梭质粒pIMP1,得到重组质粒pIMP1-ehIL-12和pIMP1-eHER2/neu.将重组质粒首先转化大肠杆菌DH5α,通过酶切和测序鉴定无误后,再用电穿孔法转化生孢梭菌；利用红霉素抗性筛选阳性克隆,采用菌液PCR和质粒提取鉴定阳性克隆,采用ELISA法对生孢梭菌培养上清中目的产物进行分析.结果 酶切和测序结果表明重组质粒内的融合基因eglAp-hIL-12和eglAp-HER2/neu序列和读框正确,菌液PCR、质粒提取和ELISA结果显示hIL-12和HER2/neu ECD基因成功修饰生孢梭菌并表达.经过20多代抗生素压力筛选,重组生孢梭菌仍能稳定携带和表达外源基因.结论 成功获得hlL-12和HER2/neu ECD基因分别修饰的生孢梭菌工程菌株,为进一步的抗肿瘤研究奠定基础.
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重组穿梭质粒pIMP1-eHER2/neu的构建及其生孢梭菌稳定转化株的筛选与鉴定
目的:制备人原癌基因HER2/neu的细胞外区域(ECD)基因修饰的重组生孢梭菌,为进一步研究其抗肿瘤作用奠定基础.方法:利用SOE-PCR将HER2/neu ECD基因连接到厌氧菌的内β1,4-葡聚糖酶的启动子和信号肽基因(eglAp)下游,构建融合基因eglAp-HER2/neu；将其插入大肠杆菌-厌氧菌穿梭质粒pIMP1,构建重组质粒；首先将重组质粒导人大肠杆菌DH5α内并进行鉴定；然后用电穿孔法将重组质粒导人生孢梭菌.利用红霉素抗性筛选重组生孢梭菌；采用菌液PCR鉴定阳性克隆.结果:酶切和测序结果显示,插入质粒pIMP1内的eglAp-HER2/neu融合基因序列及读框正确.菌液PCR结果表明,重组质粒pIMP1-eHER2/neu成功转化生孢梭菌；经过20多代抗生素压力筛选,重组生孢梭菌仍能稳定携带pIMP1-eHER2/neu.结论:成功制备了重组质粒pIMP1-eHER2/neu生孢梭菌的稳定转化株,为其进一步的抗肿瘤作用研究奠定基础.
关键词： 大肠杆菌-厌氧菌穿梭质粒 生孢梭菌 Her2/neu ECD pIMP1 -
对无菌试验培养基灵敏度试验法准确性的初步研究
目的:研究<中国生物制品规程>(2000年版)(简称<规程>)中需氧菌和厌氧菌无菌试验培养基灵敏度试验法及真菌无菌试验培养基灵敏度试验法的准确性.方法:按照<规程>中需氧菌和厌氧菌无菌试验培养基灵敏度试验法及真菌无菌试验培养基灵敏度试验法,同时采用平皿[乙型溶血性链球菌采用血琼脂平皿,短芽孢杆菌采用营养琼脂平皿,生孢子梭状芽孢杆菌(简称生孢梭菌)采用硫乙醇酸盐软固体琼脂平皿(厌氧培养),白色念珠菌采用真菌培养基琼脂平皿]计数法,在相同稀释度及培养温度条件下平行进行1mL菌液的菌落形成单位(Colony Forming Units,CFU)计数.将菌液稀释至与标准比浊管相同之浓度,然后作10倍系列稀释.将稀释度为10-6～10-8的短芽孢杆菌、10-6～10-8的生孢梭菌,10-7～10-9的乙型溶血性链球菌菌液各1 mL,分别接种到9 mL硫乙醇酸盐培养基中;将稀释度为10-5～10-7的白色念珠菌菌液各1 mL,分别接种到9mL真菌培养基.每个稀释度至少接种3管,用未接种培养基作对照.将接种短芽孢杆菌的培养基,置35℃培养5 d,接种生孢梭菌或乙型溶血性链球菌的培养基,置35℃培养3 d,接种白色念珠菌的培养基,置25℃培养5 d,同时重复3次试验,记录结果.用每个菌种,按照需氧菌和厌氧菌无菌试验培养基灵敏度试验法及真菌无菌试验培养基灵敏度试验法重复进行3次灵敏度试验.结果:按照<规程>中需氧菌和厌氧菌无菌试验培养基灵敏度试验法及真菌无菌试验培养基灵敏度试验法,同一种培养基,用同一质控菌种重复3次灵敏度试验,结果往往不同,尤其是用乙型溶血性链球菌进行质控时,更为明显.平皿CFU计数与比浊菌数常有显著差异.结论:<规程>中需氧菌和厌氧菌无菌试验培养基灵敏度试验法及真菌无菌试验培养基灵敏度试验法准确性欠佳.
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对《硫乙醇酸盐流体培养基灵敏度检查(草案)》的验证试验
目的:对新提出的<硫乙醇酸盐流体培养基灵敏度检查(草案)>的准确性、可操作性和可重复性进行验证.方法:将质控菌乙型溶血性链球菌、生孢子梭状芽孢杆菌(简称生孢梭菌)、短芽孢杆菌接种于适宜的培养基培养,取新鲜培养物用0.9%无菌氯化钠制成浊度稍高于标准比浊管的均匀菌液,然后分别用0.9%无菌氯化钠溶液进行系列稀释至约相当于10-100CFU·mL-1,作为工作菌液.取上述工作菌液分别接种于3管(1 mL·管-1)硫乙醇酸盐流体培养基中,置35℃培养72 h(短芽孢杆菌培养5 d).同时将上述工作菌液进行CFU·mL-1计数:将乙型溶血性链球菌和短芽孢杆菌采用涂抹法分别接种于血琼脂培养基和营养琼脂培养基,置有氧条件35℃培养24h,生孢梭菌采用浇注法接种于生孢梭菌CFU计数培养基,置厌氧条件35℃培养18-20 h,用未接种的培养基作为空白对照.结果:当上述3种质控菌工作菌液的平皿CFU计数在10-100CFU·mL-1时,其接种的3管硫乙醇酸盐流体培养基均呈现生长.结论:新提出的<硫乙醇酸盐流体培养基灵敏度检查(草案)>准确性、可操作性和重复性良好,易于推广和实施.可以提出作为对中国药典(2005年版)中硫乙醇酸盐流体培养基灵敏度检查的修订草案.
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双滤膜过滤方法的建立及在卡波姆眼用凝胶无菌检查试验中的应用
目的:建立卡波姆眼用制剂的无菌检查方法,探索双滤膜过滤方法运用于药品无菌检查试验的可行性.方法:用0.1％的蛋白胨水溶液稀释供试品,在供试品溶液中加入适量的10％氯化钙溶液,使卡波姆凝胶生成沉淀.采用孔径30 ～ 50μm和不大于0.45 μm 2种无菌滤膜过滤供试品溶液,分别截留沉淀物和微生物,对2种滤膜进行适量冲洗后,置适宜的培养基中进行培养.结果:6种验证用菌株,枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉在接种供试品的培养基中生长良好.采用双滤膜过滤的方法,可以有效削除供试品的抑菌活性,避免卡波姆凝胶堵塞滤膜,实现对容器中全部内容物进行检验,大程度降低实验过程对此类特殊供试品中微生物的损伤或损失.结论:双滤膜过滤方法实验过程符合中国药典2010年版无菌检查法相关规定,试验结果有效,可用于卡波姆眼用制剂的无菌检查试验.
