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蝎毒耐热蛋白对红藻氨酸诱导的海马NPY能神经元损伤的影响
目的:观察蝎毒耐热蛋白(SVHRP)对红藻氨酸(KA)诱导的原代培养海马神经肽Y(NPY)能神经元损伤的影响及其可能的分子机制.方法:制备原代培养10 d的大鼠海马神经元并用神经元特异性MAP-2抗体进行鉴定,将鉴定成熟的神经元用终浓度为20 μg/ml的SVHRP和10 μmol/L的KA处理,共孵育24 h后,分别用硫堇染色、MTT实验检测不同给药组残存神经元的数目和活力,用免疫细胞化学和RT-PCR技术检测NPY-IR和NPY mRNA的表达.结果:MAP-2-IR结果显示85%以上为阳性成熟神经元;硫堇染色显示,同模型组比较,模型给药组未见神经元形态异常,并且神经元数目未见明显减少(P＜0.05);MTT实验显示,模型给药组海马神经元存活率较模型组明显增高(P＜0.05);NPY-IR检测表明,模型组NPY阳性细神经元数目明显减少,模型给药组NPY阳性神经元数目明显多于模型组(P＜0.01);RT-PCR实验表明,单独给药组海马神经元内NPYmRNA表达较其他三组明显增多(P＜0.05).结论:SVHRP对KA诱导的原代海马神经元的兴奋毒性损伤具有明显的保护作用,可能与SVHRP促进NPY合成有关.
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蝎毒耐热蛋白对外源性Aβ活化星形胶质细胞的作用
目的 观察蝎毒耐热蛋白(SVHRP)对Aβ1-40活化星形胶质细胞(AST)作用的影响.方法 应用Aβ1-40进行大鼠海马内定位注射后腹腔给予SVHRP进行干预,16d后应用免疫组化法进行海马内GFAP免疫反应强度检测.结果 Aβ1-40注射点周围GFAP免疫反应明显增强,而经SVHRP干预后GFAP免疫反应显著减弱,接近正常对照水平.结论 腹腔注射SVHRP可抑制外源性A B1-40引起的大鼠海马内AST活化.
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蝎毒耐热蛋白对外源性Aβ1-40神经突触毒性的抑制作用
目的 探讨蝎毒耐热蛋白(SVHRP)对A β1-40神经突触毒性的影响.方法 应用A β1-40进行大鼠海马内定位注射后,腹腔给予SVHRP进行干预.1O d后,采用水迷宫实验和免疫组织化学方法分别枪测大鼠的学习记忆能力和海马内突触密度的变化.结果 SVHRP干预组大鼠的水迷宫逃避潜伏期缩短、目标象限游泳时间和距离增加;SVHRP干预组大鼠的P38免疫反应产物明显强于Aβ组,接近对照组水平.结论 腹腔注射SVHRP可抑制外源性Aβ1-40引起的大鼠海马内突触密度的下降,可阻止Aβ1-40对大鼠学习记忆能力的损害.
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蝎毒耐热蛋白对红藻氨酸诱导癫痫大鼠海马内前脑啡肽原表达的影响
[目的]观察蝎毒耐热蛋白对红藻氨酸(kainic acid, KA)癫痫大鼠癫痫敏感性形成的影响,并探讨前脑啡肽原(proenkephalin , PENK)在其机制中的作用. [方法]大鼠颈部皮下注射红藻氨酸,制备癫痫敏感性动物模型后,给予蝎毒耐热蛋白(scorpion venom heat resistant protein, SVHRP)进行干预.通过观察癫痫行为学表现检测SVHRP对癫痫敏感性形成的影响,同时应用RT-PCR技术检测不同处理组大鼠海马内前脑啡肽原表达的变化.[结果]蝎毒耐热蛋白干预组的大鼠较单独给予红藻氨酸组的大鼠癫痫敏感性形成率明显降低(P＜0.05),而且前脑啡肽原的表达也明显下降(P＜0.05).[结论]蝎毒耐热蛋白能够抑制红藻氨酸诱导大鼠癫痫敏感性的形成,前脑啡肽原可能参与其作用机制.
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不同抗癫痫药物对幼年癫痫大鼠海马胶质原纤维酸性蛋白的影响
目的：探讨左乙拉西坦（ levetiracetam ， LEV）、丙戊酸钠（ sodium valproate ， VPA）和蝎毒耐热蛋白（ scorpi-on venom heat resistant protein ， SVHRP ）对幼年癫痫大鼠海马胶质原纤维酸性蛋白（ glia fibrillary acidic protein ， GFAP）的影响。方法生后2周SD大鼠共40只，分为（1）正常对照组：正常大鼠1次/d腹腔注射生理盐水1周；（2）癫痫模型组：应用匹罗卡品制作颞叶癫痫模型，癫痫造模后，1次/d腹腔注射生理盐水1周；（3）LEV治疗组：癫痫造模后1次/d LEV灌胃（150 mg/kg）1周；（4）VPA治疗组：癫痫造模后1次/d VPA（250 mg/kg）灌胃1周；（5）SVHRP治疗组：癫痫造模后腹腔注射SVHRP（0．01 mg/kg），连续1周。用药后行免疫组化检测GFAP。结果癫痫模型组海马齿状回GFAP免疫阳性的星形胶质细胞分别与LEV治疗组、VPA治疗组和SVHRP治疗组相比明显增生（ P＜0．05）。尼氏染色结果显示LEV治疗组、VPA治疗组和SVHRP治疗组与癫痫模型组比较，海马CA3区神经元损伤较小。结论幼年大鼠癫痫发作可能与海马星形胶质细胞增生有关， LEV、VPA 、SVHRP的抗癫痫作用可能与抑制海马星形胶质细胞增生有关，但其具体作用及机制仍需进一步探讨。
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蝎毒耐热蛋白对大鼠海马神经元钠通道的抑制作用
应用全细胞膜片钳技术观察蝎毒耐热蛋白(scorpion venom heat resistant protein,SVHRP)对急性分离大鼠海马神经元电压依赖性钠通道的影响.结果表明,急性分离大鼠海马神经元产生的河豚毒素(tetrodotoxin,TTX)敏感的电压依赖性钠电流被SVHRP浓度依赖性地抑制,半数抑制浓度为(0.0034±0.0004)μg/mL,Hill常数为0.4361±0.0318;SVHRP可使钠通道稳态激活曲线向电压的正方向移动,正常TTX敏感的钠通道的半数激活电压(V1/2 )为(-34.38±0.62)mV(n=16),给予0.1μg/mL的SVHRP后V1/2为(-23.96±0.41)mV(n=8,P＜0.05),斜坡因子(κ)由正常的4.52±0.52变为3.73±0.08(n=8,P＜0.05).SVHRP亦能改变电压依赖性钠通道的稳态失活曲线,使其向电位的负方向移动,SVHRP处理前钠通道半数失活电压(V1/2)为(-32.60±1.52) mV,κ为6.73±0.51(n=16);0.1μg/mL 的SVHRP处理后V1/2变为(-50.69±2.55)mV(n=8,P＜0.01),κ为5.49±0.72(n=8,P＜0.05).结果提示,SVHRP能抑制电压依赖性钠电流,改变钠通道的动力学特性,抑制其激活,促进其失活,从而影响神经元的兴奋性,这可能是其抗癫痫的机制这一.
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蝎毒耐热蛋白对大鼠急性分离海马神经元兴奋性的影响
应用全细胞膜片钳记录技术在电流钳模式下观察经持续高温等特殊处理后分离纯化的30～50 kDa蝎毒耐热蛋白(scorpion venom heat resistant protein,SVHRP)(国家发明专利,专利号ZL01 106166.92)对急性分离大鼠海马神经元兴奋性的影响.结果发现SVHRP可致海马神经元兴奋性降低.神经元经1×10-2 μg/mL SVHRP处理后动作电位发放模式改变,发放频率减少.在52个受检细胞中,有45个细胞产生位相放电(占86.54%);7个细胞产生重复放电(占13.46%).在产生位相放电的45个细胞中,有8个细胞在SVHRP处理后仍可以诱发出位相放电(占17.78%);37个细胞在SVHRP处理后无法诱导出位相放电(占82.22%),SVHRP处理后动作电位的产生与处理前相比,有显著差异(P＜0.01,n=45);在产生重复放电的7个细胞中,在1×10-2μg/mL SVHRP作用后均不能再次诱发出重复放电,而是产生一个动作电位或不再产生动作电位,药物处理前产生的动作电位个数为14.57±1.00,SVHRP处理后产生动作电位的个数为0.57±0.20,二者之间有显著性差异(P＜0.01,n=7).1×10-4 μg/mLSVHRP处理后,诱发动作电位产生的基强度由(75.10±8.99)pA增加到(119.85±12.73)pA(P＜0.01,n=8);阈电位由(-41.17±2.15)mV升至(-32.40±1.48)mV(P＜0.01,n=8);动作电位峰值由(68.49±2.33)mV下降至(54.71±0.81)mV(P＜0.01,n=8).由于神经元超兴奋性被认为是癫痫发作的基本机制之一,因此上述结果表明SVHRP有可能通过降低海马神经元兴奋性发挥其抗癫痫作用,这为蝎毒药物的进一步开发提供理论依据.
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蝎毒耐热蛋白对大鼠海马内前脑啡肽原表达的影响
癫痫是常见的神经系统变性疾病,其在临床上顽固难治的原因是癫痫敏感性的形成.国内外文献报道[1～4]阿片肽可能是癫痫敏感性形成的机制之一.脑啡肽(enkephalin,ENK)是脑内含量高的阿片肽,广泛存在于所有的脑区.蝎毒是传统的抗癫痫药物,蝎毒耐热蛋白是通过特殊工艺从蝎毒中提取的抗癫痫组分,本工作旨在探讨蝎毒耐热蛋白对抗癫痫敏感性形成的作用及其可能的阿片肽机制.
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SVHRP对Aβ1-40处理后大鼠海马突触形态学改变的抑制作用
目的:探索蝎毒耐热蛋白(SVHRP)对淀粉样β蛋白(Aβ)神经毒性的抑制作用.方法:在大鼠海马内每侧注射Aβ1-40(10μg/2μl)后1 d,给予腹腔SVHRP(0.5～2μg/100 g),1次/d,连续10次.建模16 d后分别进行海马部位的突触体素免疫组织化学分析和突触超微结构计量观察.结果:与对照组比较,AB组大鼠突触体素免疫反应强度和电镜下突触密度明显下降(P<0.01),小突触丢失为主,突触终末可见突触小泡大量集聚,突触活性区平均长度增加.SVHRP干预组大鼠实触体素免疫反应强度和电镜下突触密度明显高于Aβ组大鼠(P<0.01),突触终末内未见突触小泡过量集聚,但小突触比例显著增加(P<0.01).结论:以上结果强有力的提示,Aβ是突触退变的始动因素,SVHRP可抑制Aβ引起的突触退变,有可能成为治疗Alzheimer病(AD)的一种药物.
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蝎毒耐热蛋白对原代培养海马神经元NPY表达的影响
探讨具有抗癫痫反复发作作用的蝎毒耐热蛋白(scorpion venom heat-resistant protein,SVHRP)对大鼠海马神经元神经肽Y(neuropeptide Y,NPY)表达的影响.采用免疫细胞化学ABC法与HPIAS系列彩色病理图文定量分析系统相结合,检测NPY-免疫阳性产物(NPY-IR)表达的变化,用RT-PCR技术观察NPY mRNA表达水平的变化.终浓度范围为0.2、2、20和200μg/ml的SVHRP分别与培养10 d的海马神经元共孵育24 h后,NPY阳性神经元的反应强度明显增强,具有剂量-反应关系.终浓度为20μg/ml的SVHRP分别与培养10 d的海马神经元共孵育3、6、9、12和24 h,NPY阳性反应强度增强,并呈时间-反应关系.RT-PCR结果显示,20μg/ml的SVHRP与原代培养海马神经元共孵育24 h后,NPY mRNA的表达明显增加.以上结果提示SVHRP可诱导原代培养海马神经元NPY阳性反应和NPY mRNA的表达.
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蝎毒耐热蛋白保护MPTP小鼠空间学习记忆障碍的一氧化氮机制
本研究的目的是探讨蝎毒耐热蛋白(SVHRP)对1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)处理的伴有空间学习记忆障碍的Parkinson病(PD)小鼠的保护机制.实验共分4组:(1)正常对照组(NS+NS),C57BL/6小鼠颈部皮下注射生理盐水(NS)连续8 d,同时腹腔注射生理盐水,连续8 d;(2)阴性对照组(NS+SVHRP):C57BL/6小鼠颈部皮下注射生理盐水,连续8d,同时腹腔注射SVHRP(0.01 mg/kg)连续8 d;(3)PD模型组(MPTP+NS):C57BL/6小鼠颈部皮下注射MPTP(20 mg/kg)连续8 d制备小鼠PD模型,腹腔注射生理盐水连续8 d;(4)蝎毒治疗组(MPTP+SVHRP):C57BL/6小鼠颈部皮下注射MPTP(20mg/kg)连续8 d,给药后腹腔注射SVHRP(0.01 mg/kg)连续8 d.行为学和形态学研究结果表明,正常对照组和阴性对照组的各项实验数据均无明显差别.爬竿和游泳实验结果表明,与正常对照组相比较,MPTP处理小鼠爬竿(P＜0.01)和游泳(P＜0.01)分数明显降低.Morris水迷宫实验中,MPTP处理小鼠寻找平台潜伏期明显延长(P＜0.01);向目标游泳时间所占百分比明显降低(P＜0.01),而向对侧象限游泳时间所占百分比明显增加(P＜0.01).免疫细胞化学染色结果表明,PD模型组小鼠中脑内黑质致密部呈酪氨酸羟化酶免疫反应阳性的神经元的数目较正常组明显减少(P＜0.01);而海马内神经元型一氧化氮合酶(nNOS)免疫反应阳性的神经元数(P＜0.01)以及NO含量(P＜0.01)均较正常组明显增多.行为学结果表明,与PD组比较,SVHRP处理的PD小鼠的运动协调能力(P＜0.01)和空间学习记忆能力(P＜0.01)均具有明显改善.
关键词： 1-甲基4-苯基-1 2 3 6-四氢吡 Parkinson病 一氧化氮 蝎毒耐热蛋白 神经保护
