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生物人工肝的研究进展
(2)单层凝胶培养单层凝胶培养的基本方法:取1.7 ml I-型胶原醋酸溶液加入60 mm Falcon培养皿中,将10倍浓度的培养液与0.34 mol/L的NaOH按2:1混匀后取0.4 ml加入上述培养皿,搅动混匀15秒就可形成凝胶,加入2.5 ml肝细胞悬液(细胞2.5×106),置于培养箱培养[37].细胞形态学的变化与胶原酶法相同,培养6小时后胶原从培养皿的周围收缩,边缘卷起.转动凝胶使凝胶从培养皿上完全游离,未粘连的细胞此时大部分到了皿底.
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分离酶法体外分离和培养人毛囊黑素细胞
越来越多的研究发现，人毛囊黑素细胞 (hair follicle melanocyte,HFM)在白癜风的色素恢复中起重要作用。 1995年 Tobin等 [1]首次报道胶原酶法体外分离培养人 HFM成功，我们加以改进后发现分离酶法更易成功。这为更好地研究人 HFM的生物学特性提供了重要基础。
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原代培养鼠肝细胞分离和培养的改良方法初探
目的探索一种简捷、高效的鼠肝细胞分离和培养方法.方法在传统的原位胶原酶灌注分离鼠肝细胞方法的基础上稍加改良,并从产量、活率、形态观察等方面加以说明.结果改良后的胶原酶法无论在产量或形态、活力方面均优于传统的胶原酶法.结论改进后的肝细胞分离和培养方法为一较为完善、简捷的方法.
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猪肝细胞分离方法的改良
目前,在供体器官短缺的情况下,大家公认猪是合适的异种器官和组织的提供者,用猪肝细胞治疗急性肝衰病人已有报道.如何将肝细胞大限度完整地、无损伤地分离出来,这是非常关键和重要的一步.我室在进行猪肝细胞的分离中,逐渐探索出一套比较行之有效的方法.材料与方法:采用中国实验用小型猪,常规麻醉、消毒、开腹,用D-Hank′s液进行肝脏原位灌注,再用0.02%EDTA-Hank′s液(37℃)灌注18～20mi n,摘取肝脏行多点灌注5min,置肝脏于60目钢网上,用直剪迅速剪开肝脏被膜,用镊子夹起轻轻抖动,并用1640液冲洗,边抖动边冲洗,使细胞滤出漏于烧杯中.与此同时,用剪刀把肝组织剪成小块,再用玻璃注射器芯轻轻研磨,边研磨边冲洗,操作要轻,并保持无菌,收集肝细胞,离心洗涤三次,并逐级用80目、100目、120目、150目钢网过滤.分离出的肝细胞进行计数、台盼蓝拒染试验检查、PAS染色、葡萄糖-6-磷酸酶染色及电镜检查.结果:肝细胞存活率90±1.3%,PAS染色显示肝糖元丰富,葡萄糖-6-磷酸酶染色显示酶的活性良好.电镜观察,肝细胞的线粒体、内质网等亚显微结构未见异常.对于猪肝细胞的分离,国外文献报道多采用Ⅳ型胶原酶循环灌注法,但费用很昂贵.在实践中,我们用EDTA代替胶原酶,采用肝脏原位灌注+多点灌注+机械研磨的方法,取得了较为满意的效果.此法与胶原酶灌注法比较,从分离的肝细胞数量、活力、肝糖元及细胞中一些酶的活性都与胶原酶法无显著差异,且光镜及电镜观察,显示细胞形态及亚细胞结构未见异常.我们认为此方法易于控制,价格低廉;而胶原酶法容易消化过度,造成细胞膜破损 ,或消化不完全造成多个细胞连在一起,且费用昂贵.实验证明,改良的猪肝细胞分离方法为用猪肝细胞治疗急性肝衰病人的研究提供了一个可行的方法.
