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同种肝细胞脾内移植治疗大鼠肝衰竭的实验研究
目的:探讨经脾内同种异体移植培养的原代肝细胞与肝细胞悬液治疗大鼠药物性肝衰竭的疗效,并观察脾内移植肝细胞的生物学特性.方法:采用D-氨基半乳糖(D-gal)建立大鼠急性肝衰竭模型,24h后随机分为3组进行治疗,Ⅰ组:经脾内移植体外培养3d的肝细胞2×107;Ⅱ组:经脾内移植预孵育8h的肝细胞悬液2×107;Ⅲ组:经脾内注射生理盐水1 mL.观察受体大鼠的存活率、肝脏功能和病理变化及移植肝细胞的生物学特性.结果:Ⅰ组、Ⅱ组大鼠存活率(78%,71%)与Ⅲ组大鼠存活率(23%)相比具有显著性差异(P＜0.01,P＜0.05),肝功能各项指标均有明显改善,肝组织病理改变较轻.而Ⅰ,Ⅱ组大鼠的存活率、肝功能改变方面,没有统计学差异.经HE和PAS染色证实,移植的肝细胞在受体脾内结构和功能保持较好.结论:经脾内移植的培养肝细胞和肝细胞悬液均能提高大鼠药物性肝衰竭的存活率、改善肝功能及肝脏组织病理变化.而培养肝细胞与细胞悬液相比,统计学上没有明显差异,但结果显示培养肝细胞仍具有一定的优越性.
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急性肝衰竭大鼠肝细胞移植的实验研究
目的:探讨大鼠同种异体肝细胞经腹腔、脾脏、门静脉移植对药物陛急性肝衰竭大鼠的治疗作用.方法:D-氨基半乳糖诱导大鼠急性肝衰竭后60 h,分6组进行治疗实验.Ⅰ组:腹腔内移植2×1010/L肝细胞悬液1 mL;Ⅱ组:腹腔内注射生理盐水1 mL;Ⅲ组:经门静脉注射2×1010/L肝细胞悬液1 mL;Ⅳ组:经门静脉注射生理盐水1 mL;V组:向脾脏内移植2×1010/L肝细胞悬液1 mL;Ⅵ组:脾内注射生理盐水1 mL.移植同时各组大鼠肌肉注射环孢霉素A(CsA)10 mg/kg,观察大鼠的存活率、肝脏功能和肝脏病理变化情况.结果:Ⅰ组大鼠存活率比Ⅱ组有明显提高(60%对20%,P＜0.01),肝脏功能及肝脏病理明显改善.Ⅲ组大鼠存活率与Ⅳ组无显著差异(20%对13.3%,P＞0.05),肝脏功能及肝脏病理未见改善.V组与Ⅵ组比较存活率有提高(47%对20%,P＜0.05).结论:经腹腔及脾脏移植同种异体肝细胞可明显改善D-gal诱导的肝衰竭大鼠的存活率,部分改善肝功能及肝脏病理;经门静脉移植同种异体肝细胞不能改善D-gal诱导的肝衰竭大鼠的存活率、肝脏功能及肝脏病理.
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生物人工肝的研究进展
(2)单层凝胶培养单层凝胶培养的基本方法:取1.7 ml I-型胶原醋酸溶液加入60 mm Falcon培养皿中,将10倍浓度的培养液与0.34 mol/L的NaOH按2:1混匀后取0.4 ml加入上述培养皿,搅动混匀15秒就可形成凝胶,加入2.5 ml肝细胞悬液(细胞2.5×106),置于培养箱培养[37].细胞形态学的变化与胶原酶法相同,培养6小时后胶原从培养皿的周围收缩,边缘卷起.转动凝胶使凝胶从培养皿上完全游离,未粘连的细胞此时大部分到了皿底.
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实验用小型猪相关生物人工肝猪逆转录病毒感染的初步研究
猪肝细胞型生物人工肝治疗肝功能衰竭在我国刚起步,而影响猪肝细胞用于临床治疗的主要问题之一是猪内源性逆转录病毒(PERV)感染[1].我们建立PCR、RT-PCR方法,检测了猪肝细胞、肝细胞悬液及经生物人工肝治疗患者治疗前后的血清,旨在初步说明PERV在上述样本中的存在和表达及生物人工肝治疗后PERV的感染情况.
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胎肝细胞输注对化疗后大鼠中性粒细胞吞噬能力的影响(简报)
据文献报道,恶性肿瘤患者化疗后输注胎肝细胞,可增强患者的抗感染能力.为了探讨其机制,笔者观察大鼠胎肝细胞输注对大鼠化疗后中性粒细胞吞噬能力的影响,报道如下.
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成人肝细胞分离及低温保存的研究
我们采用改进的胶原酶灌注技术,获取分离的成人肝细胞,并研究威斯康星(UW)保存液对细胞活力和ATP贮存的影响，现将结果报道如下。 一、材料与方法 1.主要试剂：Ⅱ型胶原酶、透明质酸酶、DNA酶I、4-2-羟乙基-1哌嗪乙磺(HEPES)均购自 Sigma公司,离解酶(Dispase)Ⅱ型购自Boehringer公司,小牛血清为Gibco产品。 2.分离方法：成人肝脏取自脑死亡供体，采用腹部多器官联合快速切取技术获取, UW液低温灌洗。切取灌洗较好的肝叶组织60～80 g(1个切面,保留3～4支血管行插管),UW液0～4 ℃保存,冷缺血时间3～8 h。肝脏获取后,以1 000 ml 初灌注液20 ml/min灌注,然后以500 ml再灌注液循环灌注至肝脏彻底消化。用镊子撕掉格林森鞘后取出肝细胞放入含体积分数为10%的小牛血清,质量分数为0.01%的DNA酶Ⅰ和Ⅱ型离解酶及0.8 mmol/L Mg2+的1640培养基中混均，尼龙网过滤。然后4 ℃,50 g离心5 min,以含钙的Hanks液漂洗3次。取细胞悬液台盼兰染色判断细胞存活率(灌注液成分见表1) 。 3.UW液保存：肝细胞悬液50 g离心后去上清,均匀悬于UW液中(含胰岛素 4 IU/L, 地塞米松 16 mg/L,血清及青霉素),4 ℃保存,一定时间后测细胞存活率, HPLC法测细胞内 ATP,生化法测乳酸脱氢酶(LDH)漏出率。在相应时段取细胞37 ℃水浴中孵育60 min,然后测细胞内ATP。 4.统计学方法：数据以均数±标准差(****±s)表示,采用t检验。 二、结果 肝细胞活力及ATP含量见表2。 三、讨论 我们应用改进的胶原酶循环灌注方法获得了纯度及存活率均较高的成人肝细胞。在切取肝叶前以UW液低温灌洗肝脏,灌注前全身肝素化, 大大减少了肝组织中红细胞的数量,初灌注时应用含乙二醇四乙酸的无钙Hanks液,提高了肝细胞的产量。灌注时用透明质酸酶,使得肝脏基质消化得更彻底, 再灌注时应用DNA酶Ⅰ及离解酶Ⅱ,可以消化坏死的肝细胞释放的DNA，使消化后的肝细胞不能凝结成块。再灌注液中含有Mg2+和Ca2+,可以稳定DNA酶，以发挥更大效果。肝脏灌注过程中产生的一些酸性产物可使灌注液的pH值下降到6.0左右,灌注液中的多数酶发挥作用的佳pH值为7.4,我们在本研究中采用15 mmol/L的H EPES作为缓冲系,可使灌注液的pH值恒定在7.4～7.5之间,而且对肝细胞的毒性很小［1］，以使各种酶类发挥佳消化效果。肝细胞消化完全后格林森鞘很容易撕去,如过度消化则可崩解成碎片。经过以上处理, 可以得到纯度及存活率均较高的肝细胞用于各种研究。
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低温保存人肝细胞Na+/H+交换与细胞内钙和细胞活力的关系
我们通过阻滞Na+/H+交换,观察低温保存肝细胞Na+/H+通道的特点及其对细胞内Ca2+和细胞存活率的影响,现将结果报道如下。 一、材料和方法 1. 试剂:Ⅱ型胶原酶,透明质酸酶,DNA酶Ⅰ,阿米洛利(A)购于Sigma公司,离解酶Ⅱ型购自Boehringer公司。 2. 肝细胞分离及保存:按照Seglen［1］的方法并做改进。肝脏获取后,以1 000 ml含乙二醇四乙酸(EGTA)0.5 mmol/L的Hanks液以每支管20 ml/min的速度灌注。然后改以500 ml含Ca2+、Mg2+,15 mmol/L的4-2-羟乙基-1-哌嗪乙磺酸(HEPES),0.5 mmol/L的Ⅱ型胶原酶和透明质酸酶的Hanks液循环灌注至肝脏彻底消化,小心取出肝细胞放入含体积分数为10%小牛血清,0.01%DNA酶I,0.01%Ⅱ型离解酶及0.08 mmol/L的Mg2+的1640培养基中混均,过滤。然后4℃,50 g离心5 min,以含钙的Hanks液漂洗至少3次。取细胞悬液台盼蓝染色判断细胞存活率。离心后肝细胞悬液均匀悬于高Na+保存液(高Na+保存液配方为：NaCl 137 mmol/L；KCl5.40 mmol/L；KH2PO40.44 mmol/L；NaH2PO41.34 mmol/L；MgSO40.83 mmol/L；CaCl21.67 mmol/L；葡萄糖10 mmol/L；半乳糖5 mmol/L；NaHCO3 10 mmol/L；HEPES 20 mmol/L；青霉素0.1 g/L；丙酮酸盐5 mmol/L)中低温保存。实验组加1 mmol/L的阿米洛利。分别于0、15、30 min、1、2、6、12 h取肝细胞行细胞内Na+、Ca2+及细胞存活率的检查。
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乳猪肝细胞分离方法的建立
生物性人工肝作为暴发性肝衰竭的一种治疗手段正在不断的发展，理想的具有完整代谢活性的肝细胞是其关键的组成部分。我们在以往研究的基础上 ［1,2］，建立起一种乳猪肝细胞的分离方法，现报道如下。 一、材料和方法 1.液体的配制：(1)细胞分离液配制：A液：含NaCl 120 mmol/L、NaHCO3 25 mmol/L 、KCl 4.8 mmol/L、MgSO4 1.2 mmol/L、KH2PO4 1.2 mmol/L。B液：含CaCl2 1.33 mmol/L、体积分数为1.6%牛血清白蛋白的A液。C液：含葡萄糖5.6 mmol/L、乙二胺四乙酸二钠0.5 mmol/L的A液。D液：含CaCl2 1.25 mmol/L、2.4%牛血清白蛋白、Ⅳ型胶原酶(Si gma公司)0.05%的C液。(2)细胞培养液配制：Williams'E培养液含：胰岛素200 U/L、表皮生长因子10 μg/L、胰高血糖素50 μg/L、氟美松2.5 mg/L、青霉素15万U/L、链霉素100 mg/L。 2.乳猪肝细胞的分离：新生雄性乳猪，腹正中切口，暴露分离腹主动脉，插管固定，以一定的压力向腹主动脉内推注含肝素(100 U/kg体重)的4 ℃ C液，同时迅速切开胸腔，夹闭胸主动脉剪开心脏，即快速推注C液300 ml，推注同时切开门静脉，插管固定，快速推注4 ℃ C液100 ml。在肾静脉以上水平剪开下腔静脉，插管固定，夹闭肝上下腔静脉，将门静脉插管连接驱动泵输出端，形成门静脉-肝脏-腔静脉循环，循环D液30 min(37 ℃，95%O2，5%CO2)，流速50 ml/min，取下肝脏， B液中轻轻剥离肝包膜，以肝上下腔静脉为中心用小木梳轻轻快速梳下肝细胞，经4层纱布滤过即得较稠厚肝细胞悬液。将肝细胞悬液在4 ℃、50 g条件离心2.5 min，弃上清， 4 ℃ B液洗2次，Willianms'E 培养液洗1次，分别以50 g条件离心2.0、1.5、1.0 min，即得较理想肝细胞悬液。 3.肝细胞存活率测定：少量肝细胞悬液与等量0.4% 台盼蓝液混合，静置1 min，显微镜下计数200个细胞，细胞核着色者为死细胞，不着色者为活细胞。 二、结果 平均肝细胞产量为(12.94±1.29) ml (含肝细胞7×1010个/L)，肝细胞存活率为90.90%。 光镜下观察，肝细胞形态完整，以单个游离肝细胞存在。 三、讨论 和大鼠相比，利用乳猪作为肝细胞来源能提供更多的肝细胞，更适合于实验研究的应用，而且和成熟肝细胞比较，乳猪肝细胞富含肝细胞再生刺激因子（包括肝细胞生长因子、肝源性肝细胞刺激物质及肝细胞生成素），这些因子能在肝细胞培养过程中修复分离时部分受损的肝细胞，从而提高了肝细胞的活性率。更有利于维持肝细胞的活性［3］，这对肝细胞的培养以及应用于生物人工肝比较有利。 利用含乙二胺四乙酸二钠平衡盐溶液较以往应用生理盐水灌洗，减轻了血细胞的聚集，更有利于祛除血管里的血细胞，使灌洗更充分、彻底，经腹主动脉进入的灌洗液一部分直接入肝，一部分经胃肠道系统循环后入门静脉达肝脏，符合肝脏的生理条件，对肝细胞起保护作用，经腹主动脉、门静脉双重灌洗，较单一血管灌流更均匀、彻底。 在肝细胞制备过程中维持37 ℃恒温及95%O2、5%CO2混合通气减少了细胞的代谢损伤，这对维持肝细胞的活性非常必要，充分洗涤可以除去残的胶原酶和细胞碎片，减少胶原酶对肝细胞的影响，特别是应用Willianms'E 培养液洗涤，提高肝细胞的存活率。 本研究结果表明，我们建立的原位胶原酶经腹主动脉、门静脉双重灌洗分离乳猪肝细胞能提供高产量、高活性的肝细胞。
