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树突状细胞与肿瘤细胞融合后诱导T细胞介导的抗肿瘤效应
目的:研究树突状细胞(DC)与肿瘤细胞(SP2/0)融合作为肿瘤疫苗免疫小鼠后抑制肿瘤生长的作用及其机理.方法:BAIB/C小鼠DC与SP2/0细胞体外融合,形成的杂交瘤分2次免疫接种同基因小鼠皮下,然后用SP2/0细胞攻击免疫的小鼠,观察肿瘤的生长情况及免疫小鼠脾细胞特异性CTL功能.结果:DC-SP2/0杂交瘤接种小鼠能产生明显的抗肿瘤效应,其拮抗SP2/0细胞攻击的能力明显强于用灭活的死SP2/0细胞与DC混合,和单用死SP2/0细胞免疫的小鼠及用生理盐水的对照组小鼠.DC-SP2/0杂交瘤免疫接种小鼠的脾细胞特异性CTL杀伤活性强于其它各组小鼠.结论:DC与肿瘤细胞融合后作为肿瘤疫苗接种可在体内产生明显的抗肿瘤免疫,其机理主要是特异性CTL的作用.
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牛分枝杆菌mpb64-ag85b-esat-6融合基因真核表达载体的构建及其在SP2/0细胞中的表达
目的 构建牛分枝杆菌mpb64-ag85b-esat-6融合基因真核表达载体,并在SP2/0细胞中表达.方法 利用PCR技术和重叠延伸剪接(SOE)技术扩增牛分枝杆菌ag85b、mpb64、esat-6基因和mpb64-ag85b融合基因,克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)上,构建重组质粒pcMAE.将该重组质粒体外转染SP2/0细胞,间接免疫荧光法检测目的 基因的表达.结果 真核表达质粒pcMAE经酶切鉴定及测序,证实构建正确,转染后SP2/0细胞膜上出现均质的蓝绿色荧光.结论 已成功构建了牛分枝杆菌mpb64-ag85b-esat-6融合基因真核表达载体,并在SP2/0细胞中获得表达,为进一步研制牛结核病多基因融合DNA疫苗奠定了基础.
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抗人T淋巴细胞CD4人-鼠嵌合抗体的真核表达
目的 在小鼠骨髓瘤细胞SP2/0中表达抗人T淋巴细胞CDM人-鼠嵌合抗体.方法 真核表达质粒PAG4622+CD4VL和PAH4604+CD4VH经酶切和序列测定后,采用电穿孔转染技术将二者共转染SP2/0细胞,经组胺醇和霉酚酸联合筛选阳性克隆,通过ELISA、流式细胞术、RT-PCR和DNA测序的方法进行初步鉴定.结果 真核表达质粒经酶切和测序鉴定证明构建正确.获得2株分泌抗人T淋巴细胞CD4人-鼠嵌合抗体的阳性SP2/0细胞克隆0925CASP2/0和1107CASP2/0,嵌合抗体表达量为0.5～2 ng/ml.结论 已成功地在SP2/0细胞中表达了抗人T淋巴细胞CD4人-鼠嵌合抗体,为该抗体在其他真核细胞中的高效表达及临床应用奠定了基础.
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单克隆抗体制品中残余SP2/0细胞蛋白含量ELISA检测试剂盒的验证
目的 对单克隆抗体制品中残余SP2/0细胞蛋白含量ELISA检测试剂盒进行验证.方法 对Cygnus Tech-nologies公司制备的SP2/0 Host Cell Proteins(HCPs)ELISA试剂盒进行灵敏度、精密性验证及基质干扰试验和样品稀释同收试验,并采用该试剂盒对本公司制备的10批单抗制品原液及冻干品进行检测.结果 标准蛋白含量的对数与相应的光吸收值的对数,在2～200 ng/ml范围内呈线性关系;该试剂盒检测限可达0.6 ng/ml,定量限可达2 ng/ml,灵敏度符合要求;检测低、中、高3个浓度的SP2/0 HCPs样品试验内及试验间变异系数分别为15.4%、3.0%、2.1%及12.0%、3.3%、1.5%;样品基质对检测无明显干扰;单抗样品检测不存在Hook效应;检测本公司10批单抗制品原液和冻干品中SP2/0细胞蛋白残留率均小于0.01%.结论 该试剂盒灵敏度高,精密性好,可用于单抗制品中残余SP2/0细胞蛋白含量的测定.
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旋转磁场联合5-FU对SP2/0细胞超微弱发光强度的影响
目的:研究旋转磁场(RMF)联合氟尿嘧啶(5-Fu)对小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)超微弱发光的影响,探讨两者联合对肿瘤细胞的杀伤作用.方法:SP2/0细胞分为四组:对照组,单纯5-FU化疗组(单化组),单纯磁疗组(单磁组),磁场联合5-FU组(磁化组).用RMF、5-FU作用于SP2/0细胞,化学发光仪进行分析.结果:对照组的化学发光强度值低,单化组、单磁组、磁化组化学发光强度值均明显高于对照组(P均<0.001).单磁组低于单化组及磁化组,有明显差别(P<0.001);磁化组的化学发光强度值高,高于单化组(P<0.001).结论:磁场和5-Fu均可引起SP2/0细胞化学发光强度值的变化,以磁场联合5-Fu的化学发光强度值变化明显,提示磁场单独及联合5-FU对SP2/0细胞有明显的杀伤作用.其机理可能与旋转磁场和5-FU引起细胞自由基增高有关.
关键词： 旋转磁场 氟尿嘧啶(5-FU) 超微弱发光 SP2/0细胞 -
人源性组织因子在SP2/0细胞中的初步表达
构建组织因子表达质粒并转染小鼠骨髓瘤细胞SP2/0,分泌表达有活性的组织因子.用阳离子聚合物法将构建好的转染质粒pIRESneo3-TF1-213转染入SP2/0细胞,经G418抗性筛选后,蛋白可由SP2/0细胞无血清培养分泌表达.G418 800ug/ml筛选到的表达克隆,经无血清培养,可分泌表达,western blot证明其为人组织因子衍生物,Mr为40k,脂化后,具有促凝血活性.成功构建组织因子蛋白表达质粒pIRESneo3-TF1-218,转染细胞可分泌表达有活性的组织因子
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汉滩病毒诱导小鼠骨髓瘤SP2/0细胞凋亡的初步研究
为研究汉滩病毒对肿瘤细胞的诱导凋亡作用,以一定量病毒悬液感染体外培养的SP2/0细胞,接种后定时间将细胞消化甩片行Gimsa染色观察凋亡细胞核的变化,制细胞悬液以流式细胞仪测细胞周期,并用免疫组化的方法检测凋亡分子Fas和FasL的表达.结果示经病毒诱导后细胞出现生长特性及形态学变化,Giemsa染色观察到典型凋亡细胞;流式细胞仪显示有凋亡峰出现;免疫组化检测出感染后SP2/0细胞中Fas和FasL表达明显升高.该结果表明汉滩病毒可诱导体外培养SP2/0细胞凋亡,其发生可能与凋亡分子Fas和FasL有关.
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鞣花酸对骨髓瘤 SP2/0细胞的作用
目的：探讨五倍子提取物鞣花酸抗骨髓瘤的生物学活性及相关机制。方法20,40和60μg·mL-1鞣花酸体外孵育骨髓瘤 SP2/0细胞株,采用细胞形态学、细胞增殖实验和流式细胞仪检测鞣花酸对 SP2/0细胞株增殖、凋亡和细胞周期的影响,通过 Western blotting 技术检测肿瘤细胞增殖与凋亡相关基因 COX-2的表达。结果20,40,60μg·mL-1鞣花酸孵育骨髓瘤 SP2/0细胞株48 h 后,细胞周期阻滞于 G1期,G1期细胞百分率分别为(55.21±3.01)%,(64.48±0.43)%,(75.10±2.46)%,与对照组(34.04±1.74)%比较,差异有统计学意义( P <0.01)。20,40和60μg·mL-1鞣花酸细胞抑制率分别为(21.18±5.92)%,(44.58±3.43)%和(70.15±2.90)%,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。细胞早期凋亡率分别为(9.60±0.56)%,(19.30±1.51)%和(35.10±5.26)%,与对照组(3.23±0.85)%比较,差异有统计学意义(P<0.01),随药物浓度的增加 COX-2的表达逐渐下降。结论鞣花酸能够抑制骨髓瘤SP2/0细胞增殖,促进其凋亡。
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小鼠SP2/0细胞移植瘤的遗传修饰位点
背景与目的:我们的研究发现BALB/c小鼠是SP2/0细胞移植瘤的敏感小鼠,而C57BL/6J小鼠则是抗性小鼠.本研究利用这两种近交系小鼠和它们杂交的F2代进行移植肿瘤重量遗传修饰位点的检测.方法:对208只BALB/cxC57BL/6J的F2代小鼠左后腿皮下注射5.0×106个SP2/0细胞,在注射后第17天处死小鼠,记录移植瘤的数量和重量.采用覆盖小鼠所有染色体的85个微卫星标记,对208只F2代小鼠进行全基因组扫描,并进行复合区间作图.结果:发现8个变异解释率>10%的位点与肿瘤生长有关(P<0.01),它们分别位于1号(DIMit113,55cM和D1Mit407,52 cM)、4号(D4Mit226,41cM)、9号(D9Mit302,55cM)、10号(D10Mit264,42cM)、11号(D11Mit115,35cM)、14号(D14Mit125,45cM)和18号染色体(D18Mit123,31cM)上.结论:个体对SP2/0细胞移植瘤的易感性受多位点变异控制,找到目标位点有助于基因单倍型确认和肿瘤易感性/抗性基因的精细研究.
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乙肝基因疫苗系列质粒的构建及其在真核细胞中的表达
目的构建一系列乙肝病毒表面抗原大、中、小蛋白的真核细胞表达质粒，并研究其在真核细胞中的表达情况。方法采用常规PCR法扩增S、前S2-S、前S1-前S2-S片断，利用重叠PCR法扩增出前S1-S片断后，分别插入Rc/CMV及pSG5UTPL/Flag载体质粒中，并在其ATG起始密码前加入KOZAK序列后转染SP2/0细胞，Western-Blot杂交检测所表达蛋白，并用核酸自动分析仪分析所插入片断的核酸序列。结果插入片断的核苷酸序列与相应的大、中、小蛋白和前S1-S 蛋白的编码基因一致，Western-Blot杂交检测出了相应的目的蛋白。结论获得了8个能高效表达乙肝病毒表面抗原大、中、小蛋白和前S1-S蛋白的真核细胞表达质粒。
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乙肝病毒S2S蛋白表达质粒NV-HB/s2s长期稳定转染细胞系(SP2/0－S2S)的建立
目的：建立乙肝病毒 S２S蛋白表达质粒NV-HB/s２s转染小鼠骨髓瘤细胞SP2/0的长期稳定转染细胞系，为后期检测乙肝核酸疫苗的细胞免疫效果提供靶细胞。方法：利用改良磷酸钙法将NV-HB/s２s 转染入SP2/0细胞，用G418抗性筛选粗筛出16株单克隆细胞株，分别用ELISA、Western-Blot 、斑点杂交、细胞免疫组化、细胞原位杂交等方法检测目的抗原蛋白的表达及NV-HB/s２s 在细胞中是否存在及定位。结果：获得一株NV-HB/s２s长期稳定转染的单克隆细胞株SP2/ 0－S２S，在细胞中检出了乙肝病毒HBsAg、preS２Ag的表达，并在细胞核中检出了NV -HB/s２s。结论：建立了乙肝病毒S２S蛋白表达质粒NV－HB/s２s转染小鼠骨髓瘤细胞SP2/0的长期稳定转染细胞系。
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表达乙肝病毒preS2S蛋白的荷瘤小鼠模型的建立
目的:建立能表达乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV)preS2S抗原蛋白的荷瘤小鼠模型,为研究HBV核酸疫苗的体内CTL应答及免疫治疗作用提供简便易行的研究模型. 方法:以免疫印迹法验证SP2/0-S2S细胞中有HBV preS2S抗原的稳定表达,将SP2/0-S2S细胞种植到BALB/c小鼠胁部皮下(荷瘤),观察能否生长成瘤,以及成瘤的时间、肿瘤大小和荷瘤后小鼠的生存时间;以免疫组织化学法检测小鼠肿瘤组织HBV preS2S抗原的表达.以不表达preS2S抗原蛋白的SP2/0-CMV细胞荷瘤小鼠作为阴性对照.结果:荷瘤后3天～1周,SP2/0-S2S细胞可在小鼠皮下形成实体肿瘤,成瘤率为100%,肿瘤细胞中有preS2S抗原表达,荷瘤后小鼠的平均生存时间为16±1天;与不表达preS2S抗原蛋白的SP2/0-CMV细胞荷瘤小鼠相比,成瘤率、成瘤时间、肿瘤大小及生存时间差异.结论:建立了能表达HBV preS2S抗原蛋白的荷瘤小鼠模型,可用于HBV核酸疫苗的体内CTL应答及免疫治疗作用的实验研究.同时也建立了不表达preS2S抗原蛋白的荷瘤小鼠模型,可用作阴性对照.
