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Smad6信号干扰对MSCs骨向分化中Smad5及Smurf1基因表达的影响
目的 研究在骨形态发生蛋白2(BMP-2)诱导的骨髓间充质干细胞(MSCs)骨向分化中Smad6信号干扰对Smad5、Smurf1基因表达的影响.方法 培养小鼠骨髓MSCs,并分为3组:A组为对照细胞;B组细胞用携带绿色荧光蛋白(GFP)的空白载体病毒转染+BMP-2骨向诱导;C组细胞用Smad6重组RNA干扰载体转染+BMP-2诱导.结果 病毒转染后GFP在MSCs中有效表达,病毒转染效率接近100%.与A组比较,BMP-2诱导24 h显著提高了B组Smurf1 mRNA 水平 (P<0.01);而Smad6信号干扰在两个时间点则进一步提高了C组Smurf1 mRNA水平,并显著高于B组(P<0.01).C组磷酸化的Smad5(pSmad5)和 Smurf1水平在两个时间点也显著高于B组(P<0.01),而Smad5蛋白水平则未受影响.结论 在BMP-2 诱导的MSCs骨向分化中,Smad6 RNA 干扰可促进Smad5磷酸化,并引起Smurf1基因表达代偿性增高.
关键词： Smad6 RNA干扰 骨髓间充质干细胞 Smad5 Smad泛素化调节因子-1 -
转化生长因子β细胞内信号转导负调控蛋白Smad6,7在肾间质纤维化大鼠肾脏表达与益气活血法的影响
目的:观察肾间质纤维化大鼠肾组织中转化生长因子β细胞内信号转导负调控蛋白Smad6,7表达变化与益气活血法中药制剂的影响.方法:实验于2006-12/2007-06在首都医科大学解剖与组织胚胎学系实验室完成.①实验动物:Wistar雄性大鼠30只,采用随机数字法随机分为模型组、中药大剂量组、中药中剂量组、中药小剂量组、西药蒙诺组、假手术组,每组5只.益气活血法中药提取液(生黄芪15 g,当归10 g,赤白芍10 g,丹参30 g,黄芩10 g,车前草15 g,牛膝15 g等)经水提醇沉得4.4 kg/L生药提取液.实验过程中对动物处置符合动物伦理学要求.②实验方法:其中前5组行单侧输尿管梗阻致肾小管间质纤维化模型手术.假手术组打开大鼠腹腔后分离左侧输尿管,并不结扎即关闭腹腔.中药大剂量组、中药中剂量组、中药小剂量组、西药蒙诺组,于手术前2 d给予灌胃给药0.072 mL/(kg·d),0.036 mL/(kg·d),0.018 mL/(kg·d),10 mg/(kg·d),1次/d,连续2周.模型组及假手术组用相同体积的生理盐水灌胃.③实验评估:6组大鼠于术后14 d麻醉后处死,观察梗阻肾组织病理改变,用免疫组化方法检测肾组织Smad6,7蛋白表达,通过医学病理图像分析系统对Smad6,7蛋白的积分光密度进行统计学分析.结果:30只大鼠全部进入结果分析.苏木精-伊红染色显示模型组肾小管上皮细胞萎缩,大部分肾小管管腔扩张,间质纤维组织增生,大量炎性细胞浸润,肾小球数目明显减少.中药大剂量组、中剂量组、西药蒙诺组较模型组肾间质炎性细胞浸润、纤维组织增生、肾小管扩张情况明显减轻.Smad6,7蛋白主要在肾皮质肾小管上皮细胞内表达,在模型组它们的表达较假手术组明显减弱且分布面积减少,两组间积分光密度差异具有统计学意义(P＜0.05);中药中剂量组、大剂量组、西药蒙诺组Smad6,7蛋白的表达较模型组明显增强、面积增加,积分光密度差异具有统计学意义(P＜0.05).结论:益气活血法可以通过诱导肾组织Smad6,7蛋白表达而抑制肾间质纤维化.
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密骨胶囊对自然衰老雄性大鼠骨髓Smad1、Smad5、Smad6基因表达的影响
目的 研究密骨胶囊对自然衰老雄性大鼠股骨骨髓中Smad1、Smad5、Smad6基因表达的影响.方法 取12月龄自然衰老SD雄性大鼠100只随机分为2组,每组50只.自鼠龄12月龄始,分别给予生理盐水、密骨胶囊灌胃,在鼠龄14、16、18、20、22月龄时,每组各取10只大鼠,取右股骨,DEXA检测BMD,取左股骨骨髓,RT-PCR半定量检测Smad1、Smad5、Smad6基因表达.结果 在14 ～ 22月龄阶段,密骨胶囊组与空白对照组相比较,密骨胶囊可维持股骨BMD (P=0.797),上调Smad1、Smad5 mRNA表达水平(P＜0.01),下调Smad6 mRNA表达水平(P＜0.01).结论 密骨胶囊可以上调股骨骨髓中Smad1、Smad5基因表达水平,下调Smad6基因表达水平,这可能是其促骨形成、修复骨损伤作用的分子机制之一.
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胰腺癌组织中Smad6和Smad7表达水平的研究
背景:转化生长因子(TGF)-β信号转导通路异常可能在胰腺癌的发病机制中占有重要地位.Smad蛋白家族是TGF-β在细胞内的信号转导分子,有关Smad6和Smad7在胰腺癌组织中是否有表达改变,目前报道尚少且结论不一.目的:研究Smad6和Smad7在胰腺癌组织中的表达及其与肿瘤临床病理特征的关系,探讨两者在胰腺癌发生、发展中的可能作用.方法:应用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分别检测17例胰腺癌和6例正常胰腺组织中Smad6和Smad7 mRNA的表达.结果:胰腺癌组织中Smad6和Smad7 mRNA的表达量分别为1.15±0.51和1.44±0.84,显著高于正常胰腺组织的0.47±0.18和0.39±0.29(P＜0.05),两者的表达与患者的性别、年龄以及肿瘤的TNM分期和分化程度均无相关性.结论:Smad6和Smad7在胰腺癌组织中存在过表达,两者可能作为癌基因参与了胰腺癌的发生、发展过程.
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Purmorphamine通过调控Smad6的表达发挥抗炎作用
目的 探讨2,6,9-三取代嘌呤化合物(PM)激活BV2细胞中SHH信号通路发挥抑制炎症作用的分子机制.方法 BV2细胞按实验需要分为①对照组;②脂多糖(LPS)组;③PM+LPS组;④PM组.PM激活BV2细胞中SHH信号通路后,应用荧光定量PCR(Q-PCR)检测Smad6、E3泛素连接酶Peli1、炎症转录因子(NF-κB)以及转化生长因子β1(TGF-β1)的mRNA表达情况.结果 与对照组比较,LPS刺激后Smad6 mRNA表达下降(P＜0.01),Peli1 mRNA和NF-κB mRNA表达升高(均P＜0.01),PM处理后能促进Smad6 mRNA和TGF-β1 mRNA表达(P＜0.01,P＜0.05);与LPS组比较,PM对LPS作用下的Peli1 mRNA和NF-κB mRNA表达起抑制作用(均P＜0.01).结论 PM激活SHH信号通路后发挥抗炎作用下调Peli1和NF-κB表达水平,可能与上调Smad6表达和增加TGF-β1表达水平有关.
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骨形态发生蛋白-7及抑制性Smads在糖尿病肾病发生发展中的表达变化
本文采用免疫组化、Western blot及荧光实时定量PCR方法,动态观察链脲佐菌素(streptozocin,STz)诱导的大鼠糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)发生早期肾脏骨形态发生蛋白-7(bone morphogenetic protein-7,BMP-7)、Smad6、Smad7蛋白及mRNA表达.结果显示,在正常及DN大鼠肾小管均有BMP-7、Smad6、Smad7蛋白表达,以胞浆表达为主.DN大鼠BMP-7、Smad6蛋白表达较正常大鼠明显增多(P＜0.05),且BMP-7的mRNA表达呈先增加后降低的状态;而Smad7蛋白和mRNA的表达均呈先增加后降低的状态.转化生长因子-β1 (transforming growth factor-β1,TGF-β1)及Ⅰ型胶原(collagentype Ⅰ,COL-I)mRNA在DN大鼠肾脏表达较正常大鼠明显增多(P＜0.05),且随着糖尿病进展有逐渐增加的趋势.结果提示,作为TGF-β超家族信号分子的一员,BMP-7信号及抑制性Smad通路在DN肾纤维化发生早期可能起重要的反馈性抑制作用.
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TGF-β1和Smad6在哮喘大鼠气道重塑中的表达及福莫特罗的影响
目的 研究转化生长因子-β1(TGF-B1)和Smad6在支气管哮喘(简称哮喘)大鼠肺组织中表达变化及福莫特罗对其表达的影响.方法 无特定病原体级(SPF)健康雄性SD大鼠60只,根据干预方法和时间分为对照组(A2和A4),哮喘组(B2和B4),福莫特罗组(C2和C4),每组10只.用卵白蛋白(ovalbumin,OVA)致敏与激发,建立哮喘大鼠气道重塑模型,福莫特罗组模型制作同哮喘组,在激发阶段,激发前30 min给予福莫特罗灌胃处理,各组均在末次激发后1～2h处死大鼠.采用图像分析技术测定肺内支气管壁厚度(Wat)及支气管平滑肌厚度(Wam);免疫组化法测定肺组织中TGF-β1,及Smad6蛋白表达.结果 (1)Wat:C2组和B2组比较差异无统计学意义(P＞0.05),两者均显著厚于A2组(均P＜0.01),C4组显著薄于B4组(P＜0.01),两者均显著厚于A4组(均P＜0.01);(2)Wam:C2组显著薄于B2组(P＜0.01),两者均显著厚于A2组(均P＜0.01),C4组显著薄于B4组,两者均显著厚于A4组(均P＜0.01);(3)肺组织TGF-β1蛋白平均吸光度值:C2组低于B2组(P＜0.05),两者均显著高于A2组(均P＜0.01),C4组低于B4组(均P＜0.05),两者均显著高于A4组(均P＜0.01);(4)肺组织Smad6蛋白平均吸光度值:C2组与B2组比较差异无统计学意义(P＞0.05),两者均显著低于A2组(均P＜0.01),C4组显著低于B4组(P＜0.01),两者均显著高于A4组(均P＜0.01).结论 TGF-β1在哮喘气道重塑大鼠肺组织中表达增高,Smad6表达减低;TGF-β1和Smad6表达失衡可能促进了哮喘气道重塑的发生和发展;福莫特罗可抑制哮喘大鼠TGF-β1表达,促进Smad6表达,作用随激发时间延长而增强.
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吡菲尼酮对牛血清蛋白诱导的肝纤维化大鼠肝损害的保护作用观察
目的：探讨吡菲尼酮对牛血清蛋白诱导的大鼠肝纤维化的影响。方法雄性Wistar大鼠30只被随机分为3组，给予模型组腹腔注射牛血清白蛋白，正常对照组接受等量的生理盐水腹腔注射,治疗组在腹腔注射牛血清白蛋白5 w后，按200 mg·kg-1·d-1灌胃给药吡菲尼酮，治疗4 w后处死试验动物，留取肝脏组织，行HE和Mas-son染色，观察肝脏病理学改变，采用免疫组化法检测Smad6蛋白表达。结果与模型组比，吡菲尼酮治疗组肝组织纤维化S3和S4期病变较模型组明显减少，炎症细胞浸润明显减少，胶原纤维间隔缩小，着色变浅；模型组肝组织Smad6相对表达量为（108.2±33.6），显著低于吡菲尼酮治疗组[（329.4±39.2），P<0.05]。结论吡菲尼酮可抑制牛血清蛋白诱导的大鼠肝纤维化，其机制与通过上调Smad 6蛋白表达有关。
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Smad6、7蛋白表达与梗阻性肾病小管间质损伤关系的实验研究
目的研究Smad6,7蛋白表达与梗阻性肾病小管间质损伤的关系.方法 32只Wistar大鼠随机分为单侧输尿管梗阻组和假手术组(对照组),于术后3、7、14、21 d处死大鼠.采用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)检测TGF-β1 mRNA表达水平;用免疫组化和Western杂交分别检测Smad6,Smad7蛋白的定位和表达;DNA片断末端标记原位检测肾小管细胞凋亡数;图像分析小管细胞和肾小球毛细血管球囊平均卡规直径的变化.判断纤维化程度通过测定肾组织羟脯氨酸含量.结果与对照组相比,梗阻肾组织TGF-β1 mRNA表达显著增高,并伴有明显的肾小管和肾小球毛细血管球囊萎缩、小管细胞的凋亡,以及肾组织羟脯氨酸含量增高.Smad6、7蛋白主要在肾小球和皮质肾小管上皮细胞内表达.输尿管梗阻后,Smad6、7蛋白表达明显下降,该Anti-Smad蛋白下调与小管间质损伤呈明显相关. 结论 TGF-β1信号通路参与了梗阻性肾病小管间质损伤的进程,Anti-Smad蛋白表达下降可能是该模型TGF-β1致伤作用加重的主要原因.
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Smad7而非Smad6基因可抑制TGF-β诱导肾小管上皮-间充质转分化
目的:观察Smad6和Smad7基因能否抑制TGF-β诱导肾小管上皮-间充质转分化.方法:构建产生表达Smad6和Smad7基因的无辅毒腺相关病毒载体, 再将病毒颗粒分别转染入人肾小管上皮细胞(HKC), 细胞随机分为正常对照、 TGF-β1组、 Smad7 组、 LacZ组、 TGF-β1+Smad7或Smad6组、 TGF-β1+LacZ组.10 μg/L TGF-β1添加入培养液孵育15、 30、 60、 120 min和3 d.Western blot测定TGF-β1和Smad6或Smad7基因转染对细胞p-Smad2、 E-cadherin、α-smooth muscle actin(α-SMA)表达的影响, ELISA法测定培养上清羟脯氨酸的含量的变化, 倒置显微镜观察细胞形态变化.结果:与未加TGF-β1细胞相比, 添加TGF-β1后15、 30、 60、 120 min胞内Smad2磷酸化水平明显增加, 30 min时表现大.10 μg/L TGF-β1与HKC孵育72 h后, 细胞α-SMA和羟脯氨酸量合成增加, E-cadherin表达减少;细胞形态变长, 呈纺锤状细胞, 失去鹅卵石样的形状.Smad7基因转染可抑制TGF-β1诱导Smad2磷酸化, 抑制细胞α-SMA和羟脯氨酸合成, 增加E-cadherin表达, 维持培养细胞的上皮样形态, 相反, Smad6没有这样的作用.结论:Smad7而不是Smad6基因转染能抑制TGF-β1诱导肾小管上皮-间充质转分化, 这些作用可能与Smad7阻断Smad2磷酸化有关.
