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低脂饮食和有氧运动干预对高脂大鼠脂肪组织蛋白激酶B表达的影响
目的:观察低脂饮食和有氧运动对高脂大鼠脂肪组织中蛋白激酶B(PKB)表达的影响.方法:选取雄性Wistar大鼠40只,随机分为正常对照组(10只)和模型组(30只).模型组大鼠给予高脂喂养,4周后,再随机分为3组:胰岛素抵抗组,继续高脂饮食;低脂饮食组,给予低脂饮食;有氧运动组,继续高脂饮食+有氧运动.干预6周后,蛋白印迹法检测大鼠脂肪组织中胰岛素刺激PKB表达的含量变化.结果:低脂饮食组和有氧运动组大鼠空腹血糖(FBG)、甘油三酯(TG)、胆固醇(TC)、内脏脂肪及胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)下降,胰岛素敏感指数(ISI)显著升高.而PKB蛋白表达分别增加了16.1%和19.2%(P＜0.01).结论:低脂饮食和有氧运动能改善胰岛素抵抗,可能与增加脂肪组织中PKB蛋白表达有关.
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巴曲酶对缺血再灌注沙土鼠海马CA1区神经元的保护作用
目的:探讨巴曲酶对沙土鼠脑缺血再灌注神经元保护作用的可能机制.方法:蒙古沙土鼠63只分为巴曲酶组45只,假手术组9只及对照组9只.对照组及巴曲酶组鼠制作缺血再灌注模型,假手术组仅行手术操作,不行缺血处理.巴曲酶组于缺血再灌注前0、0.5、1、3和6h时分别给予腹腔注射巴曲酶8 BU/kg,每个时间点9只.缺血再灌注96 h后3组鼠进行免疫组化SP法检测海马CA1区的Bcl-2、eNOS、VEGF及Akt蛋白的表达及电镜下神经元超微结构观察;并在光镜下计算海马CA1区的神经元阳性细胞数.结果:巴曲酶组使用巴曲酶后,Bcl-2、eNOS、VEGF及Akt蛋白表达明显增加,神经元阳性细胞数在各时间点与对照组比较差异均有显著性意义(P＜0.01),而巴曲酶组各个时间点间比较差异无统计学意义;超微结构显示巴曲酶各时间点抗细胞凋亡明显.结论:巴曲酶具有明显的海马CA1区的神经元保护作用,其机制可能是通过其上调Bcl-2、eNOS、VEGF及Akt蛋白的表达.
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丹参酮ⅡA对肥厚心肌信号转导系统蛋白激酶B通路的影响
目的:探讨丹参酮ⅡA对压力超负荷性心肌肥厚大鼠的细胞信号转导系统中蛋白激酶B(Akt)的影响.方法:健康雄性成年大鼠48只,采用胸主动脉部分缩窄术复制心肌肥厚模型大鼠40只,随机分为模型组(M组),缬沙坦组(X组)各8只,丹参酮组(D组)24只,另8只设为假手术组(S组).术后2周,X组大鼠给予缬沙坦10 mg/kg灌胃;D组大鼠按丹参酮5、10和20 mg/kg剂量各8只腹腔注射;S及M组大鼠给予同等容量无菌注射用水腹腔注射.各组治疗均每日1次.8周后检测各组大鼠左室心肌质量指数(LVMI),左心室后壁(LVPW)及室间隔(IVS)厚度,比较心肌纤维横径(MFD),心肌组织中p-Akt,p-Gsk3β信号转导蛋白的量.结果:与S组比较,M组、X组和D组的大鼠左室心肌质量指数,左心室及室间隔厚度及心肌纤维横径均增加,p-Akt及p-Gsk3β升高(均P<0.05),与M组比较,X组和D组各项检测指标均下降;X组与D组间比较差异无显著性意义;D组中各剂量丹参酮治疗的大鼠间比较差异无显著性意义.结论:丹参酮ⅡA可以通过作用于蛋白激酶B(Akt)信号通路,防止心肌肥厚.
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强化训练对脑缺血再灌注大鼠骨骼肌p-Akt蛋白表达的影响
目的 观察不同强度跑台训练对脑缺血再灌注损伤大鼠骨骼肌中磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)的表达及运动功能的影响.方法 选取符合纳入标准的120只大鼠,按随机数字法分为假手术组、模型组、普通训练组和强化训练组,每组30只.通过线栓法建立大鼠左侧大脑缺血再灌注(MCAO)损伤模型,假手术组不阻断大脑中动脉,不给于跑台训练;模型组大鼠MCAO造模成功后,未给予跑台训练;普通训练组大鼠MCAO造模成功后,每日给予30 min的跑台训练(普通训练);强化训练组大鼠MCAO造模成功后给予每日早晚各1次的30 min跑台训练(强化训练).分别于训练第1、3、7和14天,采用Zausinger六分法评分检测各组大鼠的神经功能情况并加以比较.于实验第3、7和14天三个时间点,每组各取5只大鼠灌注后分别取两侧腓肠肌行苏木素-伊红(HE)染色,镜下观察各组大鼠腓肠肌纤维横截面形态,镜下每个视野取10个轮廓较为完整的肌纤维,计算每根肌纤维平均横截面积及其横截面积维持率.将各组实验第3、7和14天三个时间点剩余的大鼠取患侧腓肠肌,采用Western Blotting法检测分析其p-Akt蛋白的表达情况.结果 ①给予跑台训练第1、3和7天后,普通训练组和强化训练组的Zausinger行为学评分差异无统计学意义(P＞0.05);但跑台训练第14天后,强化训练组行为学评分明显高于普通训练组(P＜0.05).②跑台训练第3天,各组大鼠腓肠肌横截面积维持率两两比较,差异无统计学意义(P＞0.05);而在跑台训练第7天和第14天时,假手术组大鼠腓肠肌横截面积维持率[(96.67±2.76)％和(94.34±6.17)％]均明显高于同时间点模型组[(70.35±2.21)％和(64.89±2.45)％]、普通训练组[(78.68±3.46)％和(71.39±5.72)％]和强化训练组[(83.31±2.89)％和(78.78±3.67)％],且组间差异均有统计学意义(P＜0.05);而且强化训练组大鼠腓肠肌横截面积维持率均明显大于同时间点的普通训练组(P＜0.05).③跑台训练第7天和第14天,强化训练组p-Akt蛋白表达水平[(0.749±0.042)和(0.689±0.064)]明显高于普通训练组[(0.578±0.072)和(0.433±0.106)],且组间差异有统计学意义(P＜0.05).结论 跑台训练可促进p-Akt蛋白的表达;强化训练比普通训练更加有利于p-Akt蛋白的表达,更能防止肌肉萎缩和改善患侧肢体功能.
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EPO激活Akt增强慢性缺氧心肌线粒体生物合成机制研究
目的:研究蛋白激酶B(Akt)在促红细胞生成素(EPO)增强慢性缺氧环境中心肌细胞线粒体生物合成中的作用机制.方法:采用H9c2心肌细胞,将其于缺氧环境下培养7 d(94％N2,1％O2,5％CO2),建立心肌细胞慢性缺氧模型.将心肌细胞根据不同处理分为缺氧对照组(HC组),20 U/ml重组人EPO(rhEPO)处理缺氧组(HE组)和20 U/ml rhEPO+100 nmol/ml wortmannin特异性阻断Akt缺氧组(HW组).以电镜观察线粒体超微结构变化,计算线粒体的体密度(Vv)、数密度(Nv);荧光探针观察检测线粒体数量变化;RT-PCR检测线粒体DNA相对拷贝数变化;Western blot检测Akt总蛋白表达及磷酸化水平变化.结果:在rhEPO作用后,Akt磷酸化显著增强(P＜0.05),电镜观察显示线粒体Vv及Nv均显著升高(均P＜0.05),线粒体数量及其DNA相对拷贝数也显著增加(P＜0.05);采用wortmannin特异性阻断Akt使其磷酸化水平显著降低(P＜0.05),同时使线粒体Vv、Nv、线粒体数量及其DNA相对拷贝数减少(均P＜0.05).结论:EPO通过促进Akt磷酸化进而增强慢性缺氧心肌细胞线粒体生物合成.
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PI3K/Akt途径在前列腺癌中的治疗前景
磷脂酰肌醇-3羟基激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路是肿瘤、炎症等发生发展过程中一条重要的信号通路.研究发现,在许多肿瘤组织中,PI3K/Akt信号通路的活化和过度表达与肿瘤的发生发展密切相关.在前列腺癌中,这种途径的激活似乎是许多侵袭性前列腺癌的特征.该途径的生物标志物将其与疾病进展风险相关联.本文回顾了PI3K/Akt途径的共同靶向方法的基本原理和相关性,以期通过更好地了解前列腺癌中PI3K/Akt途径的生物学特征,相关生物标志物和联合治疗来优化该靶向途径,从而改善侵袭性前列腺癌患者的结局.
关键词： 磷脂酰肌醇-3羟基激酶 蛋白激酶B mTOR 前列腺癌 联合治疗 -
PTEN诱导膀胱癌BIU-87细胞凋亡机制研究
目的 研究抑癌基因PTEN对人膀胱癌细胞株BIU-87细胞凋亡的影响,并探讨其相关机制.方法 将携带野生型PTEN基因及两种突变型基因C124A-PTEN和G129E-PTEN的真核表达载体转染BIU-87细胞,Western blot检测PTEN蛋白表达及蛋白激酶B(PKB/Akt)、焦点黏附激酶(FAK)磷酸化水平的变化;应用流式细胞仪技术和激光共聚焦显微镜技术,分析转染和对照细胞在黏附状态下的凋亡情况.结果 与对照组细胞相比,转染野生型PTEN的BIU-87细胞(WT-PT/87)FAK和Akt的磷酸化水平分别降低了59％(P<0.01)和89％(P<0.01),G129E-PT/87细胞内磷酸化FAK和磷酸化Akt的水平分别下降了62％(P<0.01)和46％(P<0.05),而C124A-PT/87细胞中FAK和Akt的磷酸化水平均无明显变化.WT-PT/87与G129E-PT/87细胞凋亡率分别升至(18.5±2.1)％(t=17.34,P<0.01)和(10.1±0.5)％(t=14.58,P<0.01),明显高于对照细胞,而C124A-PT/87与GFP/87细胞凋亡率无明显升高.结论 抑癌基因PTEN诱导膀胱癌细胞的凋亡与其脂质磷酸酶抑制Akt的磷酸化有关.其蛋白磷酸酶活性参与调节Akt磷酸化,其机制可能与调节FAK的磷酸化有关.
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Toll样受体2在结肠癌组织的表达及其对结肠癌细胞生长的影响
目的 观察Toll样受体2(TLR2)在结肠癌中的表达,探讨TLR2信号对结肠癌细胞生长的影响.方法 免疫组织化学染色法检测20例结肠癌组织及配对癌旁组织中TLR2蛋白表达;应用TLR2配体Pam3Cys(P3C)激活结肠癌细胞株SW480和HCT116的TLR2信号,通过细胞计数试剂盒(CCK-8)实验、划痕实验、Transwell实验观察其对结肠癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响;Western blot实验检测TLR2信号激活后结肠癌细胞磷酸肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)和核因子-κB(NF-κB)蛋白表达.结果 结肠癌组织和配对癌旁组织中TLR2蛋白表达阳性率分别为85.0％ (17/20)和40.0％(8/20),两者免疫组织化学评分差异有统计学意义(x2=8.640,P=0.003);TLR2可以促进结肠癌细胞增殖(SW480组:1.496±0.041比1.003±0.002,t =20.802,P=0.000;HCT116组:1.859±0.074比1.002±0.003,t=20.430,P=0.000),同时可以促进结肠癌细胞的迁移能力[SW480组:(72.00±11.78)％比(45.67±6.13)％,t=3.434,P=0.026;HCT116组:(64.33±15.52)％比(32.33±11.32)％,t =2.885,P=0.045]和侵袭能力(SW480组:81.3±5.3比31.3±3.7,f=13.398,P =0.000;HCT116组:58.0±5.7比19.7±3.3,t=10.072,P =0.001). TLR2信号能够激活结肠癌细胞PI3 K/Akt和NF-κB通路.结论 TLR2在结肠癌中高表达,能够通过PI3 K/Akt和NF-κB通路促进结肠癌细胞增殖、迁移、侵袭.
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埃索美拉唑抑制胃癌AGS细胞增殖与蛋白激酶B、表皮生长因子受体表达的关系
目的 探讨埃索美拉唑对人胃癌AGS细胞增殖、迁移、凋亡的影响及其与蛋白激酶B(Akt)、表皮生长因子受体(EGFR)表达的关系.方法 分别用噻唑蓝(MTT)法和Transwell实验分析不同浓度的埃索美拉唑(0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0 mg/L)对胃癌AGS细胞增殖、迁移、侵袭的影响;用流式细胞术检测埃索美拉唑(40 mg/L)作用胃癌AGS细胞48 h后其细胞凋亡;分别用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot方法检测埃索美拉唑(40 mg/L)作用胃癌AGS细胞48h后Akt、EGFR、半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase)-3、Caspase-7mRNA和蛋白的表达.结果 随着埃索美拉唑浓度的增加,胃癌AGS细胞抑制率逐渐增加(0.00、9.76％、9.97％、13.13％、24.54％、43.62％、55.59％,P=0.001),迁移细胞数逐渐减少[(247.38±7.31)、(240.35±4.30)、(225.89±7.36)、(210.27±4.16)、(181.38±6.23)、(142.46±4.13)、(122.48±6.25)个/视野,P=0.001],侵袭细胞数逐渐减少[(207.32±13.23)、(201.34±9.43)、(197.49±5.98)、(189.74±11.65)、(172.18±7.38)、(150.49±6.39)、(111.23±6.36)个/视野,P=0.001].埃索美拉唑40 mg/L处理48 h后,细胞凋亡比例显著增加(30.50％比2.88％),Akt、Caspase-3、Caspase-7mRNA和蛋白表达下降,EGFRmRNA和蛋白表达升高.结论 埃索美拉唑能抑制胃癌AGS细胞增殖,诱导其凋亡,可能与Akt表达下降、EGFR的激活有关.
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沉默泛素特异性肽酶22对人胃癌细胞增殖的影响及其机制
目的 探讨泛素特异性肽酶22 (USP22)对人胃癌细胞增殖的影响及其作用机制.方法 设计、合成针对USP22特异性小干扰RNA (siRNA)片段,通过实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)、Western blot筛选抑制效率高的siRNA片段以备后续实验;抑制USP22后,噻唑蓝(MTT)法检测胃癌细胞SGC-7901细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期及凋亡变化;抑制USP22后,Western blot检测周期、凋亡相关蛋白的表达变化.结果 成功设计、合成针对USP22 siRNA片段,其抑制效率高达80％;USP22抑制后,胃癌细胞SGC-7901增殖明显受到抑制,细胞停滞于Go/G1期[(52.87±1.41)％比(73.73±1.78)％,t=15.491,P=0.000].同时凋亡率显著增加[(19.63±0.82)％比(4.54±0.46)％,=58.051,P=0.000];Western blot结果显示bel-2相关X蛋白(bax)表达水平显著上升(t =9.580,P=0.001)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(bcl-2)及pro-半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶-3(Caspase-3)的表达量显著降低(t=6.674、7.269;P=0.000、0.000);磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)及下游磷酸化糖原合成酶激酶3β(p-GSK3β)表达水平显著降低(t=13.512、6.846;P=0.003).结论 抑制USP22后,可能通过影响Akt活化,抑制胃癌细胞增殖及诱导细胞凋亡.
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磷酸化蛋白激酶B/蛋白激酶B在不同时间大鼠重症急性胰腺炎肠道损伤的表达
目的 用5％牛磺胆酸钠诱导大鼠重症急性胰腺炎(SAP)模型,观察磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)在其中的表达,并探讨制作该模型合适的时间点.方法 雄性SD大鼠59只,随机分为5组:正常对照组(n=12)、假手术组(CON组,n=12)、SAP组(n=36)、3、6、12 h组(n=12).胆胰管逆行注射5％牛磺胆酸钠制备SAP肠道损伤模型.在3、6、12h测定腹水量,血清淀粉酶、脂肪酶水平,光镜观察胰腺及回肠病理改变,免疫组织化学观察末端回肠蛋白激酶B(Akt)及p-Akt表达.结果 SAP组随着时间点的延长,血清淀粉酶、脂肪酶水平,胰腺和回肠的病理评分逐渐升高,并且p-Akt在SAP大鼠回肠中表达也逐渐增强,在12h达到高峰(P＜0.05),且均高于CON组表达,Akt在SAP大鼠回肠中表达逐渐减少,12h少(P＜0.05),且均低于于CON组表达.结论 逆行注射5％牛磺胆酸钠12h后,可能是研究SAP大鼠肠道损伤合适的时间点.
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异氟烷对大鼠脑外伤后继发性损伤的保护作用及其机制
目的 探讨异氟烷治疗对大鼠脑外伤后继发性脑损伤的保护作用及机制.方法 采用改良Feeney自由落体法制作大鼠创伤性脑损伤模型,将80只雄性SD大鼠按随机数字法分为4组:假手术组、脑外伤组、异氟烷预处理组(脑外伤前12 h给予2％的异氟烷60 min处理)和异氟烷后处理组(脑外伤后10 min中给予2％异氟烷处理60 min),伤后12 h和24 h行神经功能评分,Western blot法检测脑外伤后24 h大脑伤灶周围皮层中磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、磷酸化糖原合成酶激酶3β(p-GSK3β)、活化半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶(cleaved-Caspase-3)和B细胞淋巴瘤/白血病-2(bcl-2)和bcl-2相关X蛋白(bax)的表达,原位缺口末端标记法(TUNEL)检测神经细胞的凋亡.结果 伤后12 h和24h,与脑外伤组(15.03 ±-3.98、15.12±4.01)比较,异氟烷预处理组(12.58±3.41、12.39±3.13)和异氟烷后处理(12.67±3.07、12.51±3.31)组中大鼠的神经功能缺损评分显著降低,差异有统计学意义(P＜0.05).与脑外伤组比较,异氟烷预处理组和异氟烷后处理组均可以显著上调p-Akt(0.11±0.07、0.98±0.13、1.01±0.17)、p-GSK3β(0.18±0.06、0.56±0.19、0.61±0.18)和bcl-2(0.13±0.05、0.41±0.13、0.49士0.15)的表达,差异有统计学意义(P＜0.05);与脑外伤组(0.78±0.18)比较,脑外伤后伤灶周围脑组织中的cleaved-Caspas-3在异氟烷预处理组(0.32±0.12)和异氟烷后处理组(0.21±0.09)被显著抑制,差异有统计学意义(P＜0.05);4组TUNEL阳性细胞个数比较,差异有统计学意义(F=7.092,P＜0.05),异氟烷预处理组和异氟烷后处理组治疗可显著减少凋亡神经细胞的个数.结论 异氟烷可能通过激活Akt/GSK3β信号通路从而在脑外伤中发挥神经保护作用.
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丁基苯酞通过磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶B通路对局部脑缺血损伤脑梗死的保护作用
目的 观察丁基苯酞对局部脑缺血损伤引起的脑梗死的保护作用.方法 制作大鼠局灶性脑缺血再灌注模型(MCAO),观察丁基苯酞对脑梗死率的影响,以及与磷酸肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)通路的关系.结果 丁基苯酞(10、30 mg/kg)给药后可以使MCAO大鼠的脑梗死率由41.2％降低至19.7％,神经功能评分由3.8分降低至2.6分,细胞角蛋白(CK)和乳酸脱氢酶(LDH)的水平由5 784 U/L和2 997 U/L降低至2 674 U/L和1 615 U/L,并且引起磷酸化Akt(p-Akt)表达增加3倍和半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase)-3表达降低约3倍.而同时给予PI3K抑制剂LY294002后,可以完全拮抗丁基苯酞引起的MCAO大鼠脑梗死率降低(梗死率由19.8％升高至40.4％)、p-Akt表达的增加和Caspase-3表达的降低.结论 丁基苯酞通过激活PI3K/Akt通路对局部脑缺血损伤引起的脑梗死产生保护作用.
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二甲双胍对骨肉瘤MG63细胞增殖及蛋白激酶B、叉头框转录因子O亚族1表达的影响
目的 观察二甲双胍对骨肉瘤细胞增殖及蛋白激酶B(Akt)信号通路中Akt、叉头框转录因子O亚族1(FoxO1)蛋白磷酸化的影响,探讨二甲双胍抑制骨肉瘤细胞增殖的作用机制.方法 以骨肉瘤MG63细胞株为研究对象,采用含有10％胎牛血清的RPMI 1640培养液在体外培养至细胞融合达70％时,更换终质量浓度为50 mmol/L的不含血清的培养液继续培养,在加入实验剂量的二甲双胍后12、24、36、48、72 h分别采用细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测细胞的增殖,收获24 h的细胞,提取总蛋白后采用Western blot检测Akt、磷酸化Akt (p-Akt)、FoxO1、磷酸化FoxO1(p-FoxOl)的表达.结果 二甲双胍可显著抑制MG63细胞增殖,呈明显的时间依赖性,用药48 h后,MG63细胞内Akt、FoxO1的磷酸化水平明显下降.二甲双胍组的p-Akt和对照组的p-Akt水平分别为0.62 ±0.04和1.33±0.16(P＜0.05),二甲双胍组的p-FoxO1和对照组的p-FoxO1水平分别为0.82 ±0.02和1.71±0.05(P ＜0.05).结论 二甲双胍可通过Akt/FoxOl信号通路的去磷酸化而抑制MG63细胞的增殖.
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肾上腺髓质素对肾肿瘤细胞中磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B信号转导通路的影响
目的 观察肾上腺髓质素(ADM)对肾肿瘤细胞中磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3 K/Akt)信号转导通路的影响.方法 将肾肿瘤细胞分为对照组、ADM组、ADM受体短发卡RNA(shRNA)组,每组又设置24、48、72h 3个时间梯度,Western blot检测各组细胞总蛋白中PI3K、Akt的表达.结果 PI3K在对照组、ADM组、ADM受体shRNA组表达分别为24 h:0.7987±0.0370、0.9342±0.0431、0.7399 ±0.0530;48 h:0.7928±0.0460、1.0328±0.0495、0.7885±0.0614;72 h:0.7986±0.0629、1.3503±0.0503、0.8032±0.0593.Akt在对照组、ADM组、ADM受体shRNA组表达分别为24 h:0.7461±0.0531、0.8365±0.0671、0.7423±0.0748；48 h:0.7411±0.0776、0.9729±0.0593、0.7462±0.0751; 72 h:0.7504±0.0724、1.0530±0.0432、0.7372±0.0715.PI3K/Akt在ADM组的表达均高于同时段对照组和ADM受体shRNA组的表达(P＜0.05).结论 ADM通过其特异性受体激活肾肿瘤细胞中PI3K/Akt信号传导通路.
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脂连素对大鼠创伤后胰岛素抵抗的作用
目的 观察创伤后胰岛素抵抗现象,探讨脂连素对手术创伤导致的胰岛素抵抗的作用和机制.方法 60只SD大鼠随机分为脂连素组(n=20)、创伤组(n=20)以及对照组(n=20).建立大鼠创伤模型,脂连索组运用脂连素进行预处理(1 mg/kg腹腔内注射),测定大鼠的血糖及血清胰岛素浓度,计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)和胰岛素分泌指数(HOMA-β)；检测骨骼肌胰岛素受体底物蛋白-1( IRS-1)、蛋白激酶B(PKB/Akt)的含量及其磷酸化状态.结果 创伤组与对照组比较血糖浓度明显升高(P＜0.05),血清胰岛素浓度先短暂下降然后逐渐升高(P＜0.05).HOMA-IR明显高于对照组(P＜0.05),HOMA-β则低于对照组(P＜0.05).脂连素组大鼠血糖浓度明显下降(P＜0.05),血清胰岛素浓度无明显改变(P＞0.05).HOMA-IR明显下降(P＜0.05),HOMA-β明显上升(P＜0.05).创伤组与对照组、脂连素组与创伤组大鼠骨骼肌中总的IRS-1及PKB/Akt蛋白含量无明显差异,但创伤组较对照组大鼠骨骼肌的IRS-1酪氨酸(Tyr)位点的磷酸化水平下降了31％[ (88.54±33.48)比(128.60±33.19),F=0.108,P＜0.01],丝氨酸(Ser)位点磷酸化水平增加了64％[(154.31±36.94)比(94.20±27.88),F=0.602,P＜0.01],PKB/Akt的磷酸化水平下降了46％[ (46.58±2.48)比(86.32±3.31),F=0.153,P＜0.01].脂连素组大鼠的骨骼肌IRS-1 Tyr位点的磷酸化水平较创伤组上升了23％[(109.05±30.77)比(88.54±33.48),F=0.012,P＜0.01],而Ser位点磷酸化水平下降了30％ [(118.65±33.49)比(154.31±36.94),F=0.272,P＜0.01],PKB/Akt的磷酸化水平上升了56％[ (72.73±2.95)比(46.58±2.48),F=0.473,P＜0.01].结论 大鼠创伤后存在胰岛素抵抗现象,其机制与胰岛素受体后信号转导通路受阻有关.脂连素能缓解创伤后胰岛素抵抗途径的发生和发展,从而改善创伤后胰岛索抵抗产生的高血糖.
关键词： 脂连素 创伤 胰岛素抵抗 胰岛素受体底物蛋白1 蛋白激酶B -
红色荧光蛋白标记蛋白激酶B的慢病毒构建和表达
目的 构建、包装并鉴定携带红色荧光蛋白(DsRed)标记的蛋白激酶B(akt1)的慢病毒.方法 通过逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)扩增1488 kb mouse akt1基因片段,通过TA克隆将akt1接入T载体,然后和IRES-dsred、pXZ208连接.酶切、测序鉴定正确的重组体(pXZ208-akt1-IRES-dsred).三质粒系统经磷酸钙法包装病毒,荧光显微镜和流式细胞仪(FACS)检测病毒滴度.Western blot比较病毒感染组与未感染组AKT1蛋白表达.pXZ208-akt1-IRES-dsred慢病毒和绿色荧光蛋白标记(GFP)的慢病毒共感染真核细胞,荧光显微镜观察两者的表达.结果 经鉴定转移质粒构建正确,荧光显微镜观察293FT表达DsRed,FACS测得病毒滴度为(1.245±0.250)×107/ml.Western blot证实病毒感染组与未感染组比较AKT1蛋白表达增高(P＜0.05).与GFP标记的慢病毒共感染真核细胞,荧光显微镜观察到共同表达DsRed和GFP.结论 DsRed标记akt1慢病毒构建和表达成功.DsRed和GFP标记慢病毒共感染真核细胞可观察到表达两种荧光蛋白.
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胃癌组织表皮生长因子受体和下游信号的表达及临床意义
目的 检测胃癌组织中表皮生长因子受体(EGFR)、蛋白激酶B(AKT)、细胞外信号调节激酶(ERK)的表达,探讨3种蛋白在胃癌发生发展及侵袭、转移中的作用.方法 采用免疫组织化学方法(SP法)检测84例胃癌组织及15例正常胃组织中EGFR、AKT、ERK的表达,分析EG-FR、AKT、ERK的表达与胃癌患者临床病理特征及预后的关系.结果 (1)在84例胃癌组织中EG-FR、AKT、ERK过表达率分别为29.7%、31.0%和33.3%,正常胃组织的过表达均为0,差异有统计学意义(P<0.05);(2)Ⅲ+Ⅳ期患者AKT过表达率为39.7%,明显高于Ⅰ+Ⅱ期患者(11.5%)(P<0.01);(3)T3+T4组AKT的过表达率为37.9%,明显高于T1+12组(5.6%)(P<0.01);淋巴结阳性者AKT的阳性率为40.4%;明显高于阴性者(18.9%)(P<0.05).(4)EGFR、AKT、ERK过表达者总生存及无进展生存期明显低于低表达者.结论 检测胃癌组织中的EGFR、AKT、ERK表达,有助于胃癌的诊断及对胃癌的恶性程度的判断和预后的评估.
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不同癌细胞系对营养剥夺的耐受性及其机制
目的 观察不同癌细胞系对营养剥夺状态下的耐受性,并探讨其可能机制.方法 观察不同癌细胞系在无血清、氨基酸和葡萄糖的情况下,各种细胞系的存活时间,同时检测其PKB/Akt的表达情况.同时将反义Akt转染人PANC-1细胞系,观察其对耐受性的影响.结果 在营养剥夺情况下,肝癌细胞系HepG-2,HLE在36 h内死亡;高分化胃癌细胞系MKN28存活时间低于36h,而低分化胃癌细胞系MKN45存活时间超过36 h;胰腺癌细胞系PANC-1存活时间显著延长,超过48 h;在对营养剥夺耐受良好的癌细胞系中,PKB/Akt呈高表达.转染Akt1和Akt2反义RNA者可以显著降低PANC-1耐受性,而转染Akt3则无此效应.结论 不同癌细胞系对营养剥夺的耐受力不同,且与PKB/Akt的表达相关.
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RNA干扰沉默蛋白激酶B基因表达对血管平滑肌细胞增殖活性的影响
目的 构建靶向蛋白激酶B(PKB/Akt)基因的逆转录病毒RNA干扰表达载体,观察其对血管平滑肌细胞(VSMC)增殖活性的影响.方法 针对大鼠PKB/Akt基因序列(NM_033230)设计多个短发夹环RNA(shRNA)序列,化学合成法合成单链寡核苷酸序列,pGEM-T载体克隆后双酶切,将cDNA序列插入逆转录病毒载体pLKIN,脂质体介导转染包装细胞PT67后获得PKB/Akt的重组逆转录病毒RNA干扰载体,感染血管平滑肌细胞(VSMC),Northern blot和Western blot法检测Akt及其下游底物-核糖体蛋白S6激酶(p70s6k)等表达的变化,流式细胞仪检测VSMC细胞周期的变化,噻唑盐(MTT)比色法检测VSMC增殖活性的改变.结果 shRNA序列经T载体克隆,酶切确定该片段为PKB/Akt基因shRNA序列;感染VSMC,证实其能够显著抑制PKB/Akt的mRNA和蛋白产物表达,下游的p70s6k表达相应减少;被感染VSMC的分裂、增殖过程受阻,更多细胞停滞在G0/G1期.结论 成功构建PKB/Akt基因逆转录病毒shRNA载体,感染VSMC能够明显抑制其分裂、分化和增殖.
