金线莲转录组测序及其黄酮类合成相关基因分析
摘要： 首次采用RNA-seq高通量测序技术对不同种植时期的金线莲进行转录组测序,并通过Q-PCR和HPLC对其结果进行验证和分析.转录组测序共获得金线莲51370条基因,并注释到Nr、GO、Swiss-Prot、KEGG和KOG数据库,根据同源序列比对,与油棕和海枣的同源性高.通过比较不同生长时间的金线莲转录组,分析其差异基因主要集中在黄酮类生物合成相关基因,运用Q-PCR对6个黄酮类生物合成相关基因(反式肉桂酸4-单加氧酶、咖啡酰辅酶A O-甲基转移酶、查尔酮合成酶、黄酮醇合成酶、莽草酸O-羟基肉桂酰转移酶、黄酮类3′,5′-羟化酶)表达量进行验证;并结合HPLC对相应的金线莲样品中6种主要黄酮类成分(芦丁、异槲皮苷、水仙苷、槲皮素、山柰酚和异鼠李素)进行含量测定.结果表明6种主要黄酮类成分含量随着金线莲黄酮类合成基因的表达量的升高而增加,并结合转录组数据,绘制出金线莲中黄酮类成分的生物合成途径.此研究为金线莲黄酮合成关键基因及黄酮类成分生物合成提供重要的遗传信息,同时为其药用价值开发提供依据.
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金线莲转录组测序及其黄酮类合成相关基因分析
首次采用RNA-seq高通量测序技术对不同种植时期的金线莲进行转录组测序,并通过Q-PCR和HPLC对其结果进行验证和分析.转录组测序共获得金线莲51370条基因,并注释到Nr、GO、Swiss-Prot、KEGG和KOG数据库,根据同源序列比对,与油棕和海枣的同源性高.通过比较不同生长时间的金线莲转录组,分析其差异基因主要集中在黄酮类生物合成相关基因,运用Q-PCR对6个黄酮类生物合成相关基因(反式肉桂酸4-单加氧酶、咖啡酰辅酶A O-甲基转移酶、查尔酮合成酶、黄酮醇合成酶、莽草酸O-羟基肉桂酰转移酶、黄酮类3′,5′-羟化酶)表达量进行验证;并结合HPLC对相应的金线莲样品中6种主要黄酮类成分(芦丁、异槲皮苷、水仙苷、槲皮素、山柰酚和异鼠李素)进行含量测定.结果表明6种主要黄酮类成分含量随着金线莲黄酮类合成基因的表达量的升高而增加,并结合转录组数据,绘制出金线莲中黄酮类成分的生物合成途径.此研究为金线莲黄酮合成关键基因及黄酮类成分生物合成提供重要的遗传信息,同时为其药用价值开发提供依据.
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毛萼香茶菜醇提物对干酵母致热大鼠解热机制研究
为探究毛萼香茶菜醇提物的解热药效及作用机制,采用背部皮下注射干酵母构建SD大鼠发热模型.实验分为空白组、模型组、阳性药扑热息痛组(150 mg/kg)、毛萼香茶菜醇提物低高剂量组(200 mg/kg、800 mg/kg)、迷迭香酸组(150 mg/kg)、蓟黄素组(150 mg/kg)、毛萼晶D组(150 mg/kg).动物造模4 h后给药治疗,造模8 h后眼眶采血和组织取材.通过测定造模后各组大鼠肛温的变化考察药效,检测血清中肿瘤坏死因子(TNF-α)和精氨酸加压素(AVP)、下丘脑前列腺素E2(PGE2)和环磷酸腺苷(cAMP)和脑腹中隔区精氨酸加压素(AVP)的含量初步探究作用机制.结果显示,总提取物能够显著抑制大鼠肛温的上升,降低血清中TNF-α含量,升高AVP含量,并降低下丘脑中PGE2、cAMP及脑腹中隔区AVP的含量.但迷迭香酸、蓟黄素和毛萼晶D对发热大鼠肛温的上升抑制不明显,且不影响发热大鼠上述生化指标的变化.上述研究结果表明,毛萼香茶菜醇提物具有良好的解热作用,其机制可能与抑制内生致热源TNF-α、中枢体温正调节介质cAMP和PGE2的分泌,以及促进中枢体温负调节介质AVP的分泌有关,但作用物质基础还有待进一步研究.
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白鲜皮化学成分及其α-葡萄糖苷酶抑制活性
采用硅胶、凝胶柱色谱方法对白鲜皮(Dictamnus dasycarpus)的化学成分进行分离纯化.从其石油醚部位分离得到了5个化合物,利用IR、MS和NMR等技术对分离得到的化合物进行了结构鉴定.5个化合物的结构分别为:二十二烷醇(1)、2,2-二二苯甲基-3,3-二苯基丙酸乙酯(2)、柠檬苦素(3)、黄柏酮(4)和白鲜碱(5).其中化合物2为新化合物,化合物1首次从该植物中分离得到.采用PNPG法筛选化合物的α-葡萄糖苷酶抑制活性.结果表明化合物3～5表现出较好的α-葡萄糖苷酶的抑制活性.该结果为白鲜皮的深度开发利用提供了理论依据.
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基于UFLC-IT-TOF/MS技术分析不同产地黄芪的化学成分
为研究不同产地黄芪的化学成分差异,制备了甘肃和内蒙古2个产地共15批黄芪药材的水煎液,利用超快速液相色谱-离子阱飞行时间质谱仪(UFLC-IT-TOF/MS)采集15批黄芪药材水煎液化学成分的指纹图谱,进而运用偏小二乘-判别分析(PLS-DA)和(非)参数检验对数据进行模式识别和统计分析,以变量投影重要性大于1、统计学差异小于0.05以及倍数变化大于1.5为阈值,筛选并鉴定其差异成分.结果发现,不同产地的黄芪水煎液中毛蕊异黄酮、芒柄花素、亚油酸等7个化学成分的含量有明显差异,涉及木脂素、黄酮、脂肪酸等4种类别.本研究为黄芪药材的全面质量控制、准确区分产地以及合理种植栽培提供了重要依据.
关键词： 黄芪 产地 UFLC-IT-TOF/MS 化学成分 质量标志物 -
灵芝孢子油体外抗肿瘤活性比较研究
探讨灵芝孢子油对于不同肿瘤细胞的抗肿瘤活性差异,选取人肝癌细胞(HepG2)、人非小细胞肺癌细胞(A549)、人结肠癌细胞(HCT116)为待检测肿瘤细胞株,采用MTT法进行细胞活力检测,Western blot法检测NF-κB信号通路激活程度,Caspase-3活性检测法检测Caspase-3酶活性来对灵芝孢子油的抗肿瘤活性机制进行初步探讨,并对3种肿瘤细胞的抗肿瘤活性进行比较.经MTT细胞活力实验验证,发现灵芝孢子油对3种肿瘤细胞的生长均具有一定抑制作用,其抑制强度依次为A549细胞、HepG2细胞、HCT116细胞;Western blot检测结果显示,灵芝孢子油能促进NF-κB通路的激活,3种肿瘤细胞比较下,A549细胞NF-κB信号通路激活程度强,其次为HepG2细胞,对HCT116细胞作用弱;Caspase-3活性检测结果显示,灵芝孢子油能激活Caspase-3依赖的凋亡相关途径,其中对A549细胞Caspase-3酶激活程度强,对HepG2细胞作用较强,对HCT116细胞作用弱.因此,本研究发现,灵芝孢子油对3种肿瘤细胞的生长均具有一定抑制作用,其抗肿瘤活性呈时间剂量依赖性,其机制可能与激活NF-κB通路与Caspase-3凋亡途径加速肿瘤细胞凋亡坏死相关.3种肿瘤细胞生长抑制实验结果显示,灵芝孢子油对A549细胞的抗肿瘤活性明显,其次为HepG2细胞,对HCT116细胞的抗肿瘤活性弱.
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普瑞巴林微孔渗透泵片的制备及体外评价
制备日服1次的普瑞巴林微孔渗透泵片,并进行处方优化和释药机制考察.采用单因素试验考察了处方和工艺因素对普瑞巴林释放的影响,并对柠檬酸钠、聚乙二醇400的用量和包衣增重3个因素进行3水平的正交试验.结合单因素和正交试验结果得到优处方和工艺,终处方为普瑞巴林82.5 mg,微晶纤维素40％,柠檬酸钠27.5％,硬脂酸镁0.5％,黏合剂为5％聚乙烯吡咯烷酮K30溶液,包衣液为醋酸纤维素和60％PEG400致孔剂,包衣增重为3％.释药动力学研究表明,所制备的微孔渗透泵片释放机制以渗透压机制为主,受pH影响较小.对普瑞巴林微孔渗透泵片释放曲线进行拟合,显示12 h内的释放曲线与零级方程拟合的相关性高,相关系数为0.9916,呈零级动力学特征.所得微孔渗透泵片可有效减缓药物释放,可提高药物安全性和减少用药次数,有一定的应用前景.
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三尖栝楼的抗肿瘤活性成分
采用硅胶、反相高效液相色潽等柱色谱技术,结合现代波谱学方法及理化性质分析,从三尖栝楼(Trichosanthes tricuspidata)干燥根醇提物二氯甲烷部位中共分离鉴定了10个化合物,其中1个hexanorcucurbitane苷类新化合物:kheka-daengoside O(1),以及9个已知化合物,分别为:khekadaengoside C-E,K(2～5),葫芦素J-2-O-β-吡喃葡萄糖苷(6),葫芦素K-2-O-β-吡喃葡萄糖苷(7),葫芦素B,J,K(8～10).利用人肝癌细胞BEL-7402对分离得到的化合物1～10进行体外抗肿瘤活性评价.结果表明,化合物8～10具有显著的抗肿瘤活性.
关键词： 三尖栝楼 hexanorcucurbitane苷 抗肿瘤活性 化学成分 结构鉴定 -
基于LC-MS/MS研究异夏佛塔苷在大鼠体内药代动力学及其绝对生物利用度
建立LC-MS/MS法测定大鼠血浆中异夏佛塔苷的浓度,研究异夏佛塔苷在大鼠体内的药代动力学特性及其绝对生物利用度.分别灌胃给药1.5、3.0、6.0 mg/kg和静脉注射异夏佛塔苷0.5 mg/kg后,建立LC-MS/MS分析方法测定大鼠血浆中异夏佛塔苷的含量,运用DAS 3.0软件计算药代动力学参数.异夏佛塔苷在1.0～500.0 ng/mL内线性良好(r=0.9976),专属性、精密度和准确度、基质效应和提取回收率以及稳定性均符合生物样本分析要求.药代动力学参数显示:灌胃给药低、中、高3个剂量组,cmax分别为(109.34±22.87)、(259.84±95.35)、(499.26±288.09)ng/mL,AUC0-t分别为(310.57±46.18)、(552.67±207.14)、(1075.03±371.19)h·ng/mL,t1/2分别为(2.36±0.22)、(2.91±0.19)、(3.04±0.86)h,tmax分别为(1.03±0.25)、(1.18±0.17)、(1.5±0.43)h,MRT0-t分别为(11.33±1.53)、(11.27±1.09)、(8.29±0.76)h;静脉注射后,AUC0-t为(1536±421.3)h·ng/mL,t1/2为(2.57±0.46)h,MRT0-t为(9.55±2.37)h,绝对生物利用度分别为6.73％,5.99％,5.80％.结果表明,本研究所建立的LC-MS/MS分析方法可应用于异夏佛塔苷在大鼠体内的药代动力学特性研究.
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人DNase I的表达、纯化及降解NETs活性研究
为获得纯度较高的人脱氧核糖核酸酶Ⅰ(DNase I)以研究其对中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps,NETs)的降解作用,构建基因工程表达菌E.coli Rosetta(DE3)/pET32a-His-DNase I,乳糖诱导表达,经镍柱亲和纯化获得融合蛋白His-DNase I.提取小鼠中性粒细胞,用佛波酯PMA刺激形成NETs,SytoxGreen及荧光显微镜检测融合蛋白对NETs的降解活性.结果表明,成功构建人DNase I基因克隆并在原核细胞中实现高效表达,纯化的His-DNase I具备较高的核酸酶活性.本研究为进一步探究DNase I的临床应用奠定了理论基础.
关键词： 脱氧核糖核酸酶Ⅰ 中性粒细胞胞外诱捕网 分离纯化 His标签 -
布地奈德直肠原位温敏凝胶的处方设计与优化
优化布地奈德直肠原位温敏凝胶的制剂处方.采用冷法配制凝胶溶液,反转试管法测定胶凝温度,以胶凝温度为指标,采用星点设计-效应面法,对泊洛沙姆407(P407)、泊洛沙姆188(P188)以及羟丙甲基纤维素(HPMC)的用量进行优化,并考察在大鼠体内的胶凝情况,以Franz扩散池法考察释放性能.确定的优处方为布地奈德0.002% ,HPMC 0.93% , P188 2.00% ,P407 18.31% .优化确定了布地奈德直肠用原位温敏凝胶的制剂处方,其能够在直肠广泛与黏附,并长时间释放药物.
