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血管紧张素-(1-7)对Toll样受体4介导的人脐静脉内皮细胞氧化应激的作用及机制

闫文凤；薛晶晶；杨慧宇；梁斌；杨志明

关键词：血管紧张素类 Toll样受体4 氧化性应激

摘要： 目的观察Toll样受体4(TLR4)在氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导人脐静脉内皮细胞发生氧化应激反应中的作用,并探讨血管紧张素(Ang)-(1-7)对上述反应的作用及其作用机制.方法体外培养人脐静脉内皮细胞,并将细胞分为6组,分别为对照组(不干预)、ox-LDL组(以ox-LDL 75 mg/L干预)、ox-LDL+ Ang-(1-7)组[Ang-(1-7)1μmol/L预处理30 min后,以ox-LDL75 mg/L干预]、ox-LDL+ Ang-(1-7)+ A-779组[A-779(Mas受体阻断剂)1μmol/L预处理30 min,然后以Ang-(1-7)1 μmol/L预处理30 min,再以ox-LDL 75 mg/L干预]、ox-LDL+A-779组(A-779 1 μmol/L预处理30 min后,以ox-LDL 75 mg/L干预)、ox-LDL+ HTA125组[HTA125(TLR4特异性阻断抗体)10 μg/L预处理30 min后,以ox-LDL 75 mg/L干预].干预24 h后,分别以膜联蛋白V(Annexin V)-FITC/碘化丙啶(PI)双标记流式细胞术和末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记测定法(TUNEL)检测细胞凋亡,2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)标记法检测活性氧自由基(R OS)水平,实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测TLR4和NADPH氧化酶4 (NOX4)的mRNA表达水平,Western blot检测TLR4和NOX4的蛋白表达水平.结果 (1)AnnexinV-FITC/PI双标记流式细胞术显示,ox-LDL组的细胞凋亡比例高于对照组[(21.18±1.40)％比(1.59 ±0.26)％,P＜0.01],ox-LDL+ Ang-(1-7)组[(7.42±1.07)％]和ox-LDL+ HTA 125组[(9.19±1.01)％]的细胞凋亡比例均低于ox-LDL组(P均＜0.01),ox-LDL+ Ang-(1-7)+A-779组[(19.91±1.30)％]和ox-LDL+ A-779组[(20.47±0.95)％]的细胞凋亡比例均高于ox-LDL+ Ang-(1-7)组(P均＜0.01).(2)TUNEL法显示,ox-LDL组的细胞凋亡比例高于对照组[(10.83±0.77)％比(2.83±0.82)％,P＜0.01],ox-LDL+ Ang-(1-7)组[(3.66±0.54)％]和ox-LDL+ HTA125组[(4.97±0.60)％]的细胞凋亡比例均低于ox-LDL组(P均＜0.01),ox-LDL+ Ang-(1-7)+A-779组[(10.69±0.62)％]和ox-LDL+ A-779组[(11.43±0.42)％]的细胞凋亡比例均高于ox-LDL+ Ang-(1-7)组(P均＜0.01).(3)ox-LDL组的ROS水平高于对照组(0.093±0.014比0.053±0.011,P＜0.01),ox-LDL+ Ang-(1-7)组(0.063±0.011)和ox-LDL+ HTA125组(0.070±0.010)的ROS水平均低于ox-LDL组(P值分别＜0.01和0.05),ox-LDL+ Ang-(1-7)+A-779组(0.088±0.003)和ox-LDL+A-779组(0.095±0.005)的ROS水平均高于ox-LDL+ Ang-(1-7)组(P均＜0.01).(4)ox-LDL组NOX4的mRNA表达水平高于对照组(11.74±0.65比1.00±0.00,P＜0.01),ox-LDL+ Ang-(1-7)组(2.85±0.75)和ox-LDL+ HTA125组(5.57±0.52) NOX4的mRNA表达水平均低于ox-LDL组(P均＜0.01),ox-LDL+ Ang-(1-7)+A-779组(10.51 ±0.54)和ox-LDL+ A-779组(11.04±1.01) NOX4的mRNA表达水平均高于ox-LDL+ Ang-(1-7)组(P均＜0.01).ox-LDL组TLR4的mRNA表达水平高于对照组(27.60±1.86比1.00±0.00,P＜0.01),ox-LDL+ Ang-(1-7)组(8.00±1.03)和ox-LDL+HTA125组(14.83±0.97) TLR4的mRNA表达水平均低于ox-LDL组(P均＜0.01),ox-LDL+Ang-(1-7)+ A-779组(24.81 ±2.19)和ox-LDL+ A-779组(26.64±0.65) TLR4的mRNA表达水平均高于ox-LDL+Ang-(1-7)组(P均＜0.01).(5)ox-LDL组NOX4的蛋白表达水平高于对照组(0.61±0.09比0.23±0.02,P＜0.01),ox-LDL+ Ang-(1-7)组(0.27±0.03)和ox-LDL+ HTA125组(0.22±0.02) NOX4的蛋白表达水平均低于ox-LDL组(P均＜0.01),ox-LDL+ Ang-(1-7)+A-779组(0.58±0.06)和ox-LDL+ A-779组(0.61±0.03) NOX4的蛋白表达水平均高于ox-LDL+Ang-(1-7)组(P均＜0.01).ox-LDL组TLR4的蛋白表达水平高于对照组(0.18 ±0.02比0.08±0.01,P＜0.01),ox-LDL+ Ang-(1-7)组(0.07±0.01)和ox-LDL+ HTA125组(0.09±0.01)TLR4的蛋白表达水平均低于ox-LDL组(P均＜0.01),ox-LDL+Ang-(1-7)+A-779组(0.18±0.02)和ox-LDL+A-779组(0.20±0.02) TLR4的蛋白表达水平均高于ox-LDL+ Ang-(1-7)组(P均＜0.01).结论 TLR4在ox-LDL诱导人脐静脉内皮细胞损伤中起介导作用,Ang-(1-7)通过特异性Mas受体发挥对细胞的保护作用.

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