流感病毒为载体重组病毒株rHCV/FLU的构建及初步评价
摘要： 目的 构建及拯救以流感病毒为载体嵌合HCV抗原表位的重组病毒株rHCV/FLU并对其进行评价.方法 利用反向遗传学技术,选择流感病毒A/Puerto Rico/8/34(PR8)为载体,将HCV 1b亚型的E1抗原基因经序列优化插入到PR8流感病毒NS1片段的特定位置,构建重组质粒pNS1-HCV,测序正确的重组质粒pNS1-HCV与PR8的7个重组质粒pHW191-PB2、pHW 192-PB1、pHW193-PA、pHW194-HA、pHW195-NP、pHW196-NA、pHW197-M转染共培养的COS-1和MDCK细胞,经拯救、筛选、鉴定获得流感病毒为载体嵌合HCV抗原表位的重组病毒株,命名为rHCV/FLU,并通过血凝试验、RT-PCR、Westernblot、电镜观察病毒形态等方法对重组病毒鉴定.接着,重组病毒接种SPF鸡胚扩大培养、超滤浓缩、蔗糖密度梯度离心纯化.纯化获得的重组病毒抗原,滴鼻免疫Balb/c小鼠,0d、14d免疫2次,设置104TCID50、 105TCID50、 106 TCID503个剂量组,初步评价其免疫效果.结果 成功拯救重组病毒株rHCV/FLU,血凝效价(HA)为29-10,病毒滴度Log10(TCID50/md)为6.5.滴鼻免疫小鼠二免后14d取小鼠血清及脾淋巴细胞,3个剂量组针对流感病毒的血抑(HI)效价均值分别为80、640和1 280,初步证明重组病毒株rHCV/FLU在小鼠体内能够产生较强体液免疫和细胞免疫应答反应.结论 成功制备的重组病毒株rHCV/FLU在动物体内具有较好的免疫效果,为新型HCV疫苗的研制提供新的研究策略.
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CD1d基因敲除小鼠拮抗DSS诱导结肠炎
目的 以葡聚糖硫酸钠 (dextran sulphate sodium, DSS) 诱导的CD1d-/-小鼠实验性结肠炎模型为研究对象, 探究CD1d分子在小鼠结肠炎进程中的作用.方法 取SPF级C57BL/6小鼠和CD1d-/-(C57BL/6背景) 小鼠, 每天给予2.5％DSS喂养, 连续6 d, 每天记录小鼠的体质量变化、粪便性状、活动情况等, 评估小鼠的疾病活动指数 (DAI), 记录小鼠的生存情况.第6天用FITC-dextran灌胃检测肠通透性, 测量结肠长度, 并用HE染色法观察结肠组织病理学变化, 免疫组化法与免疫荧光法检测肠上皮增殖情况, 免疫印迹 (Western blot) 检测小鼠结肠组织细胞炎性因子的表达.结果 与C57/BL6小鼠相比, CD1d-/-小鼠生存率高 (P＜0.05), 体质量减轻缓慢、疾病活动指数 (DAI) 低 (P＜0.05), 结肠长度长、肠通透性低 (P＜0.01), 肠黏膜损伤轻, 结肠上皮细胞增殖明显 (P＜0.05), 肠组织IL-1beta及IL-18表达高 (P＜0.05) .结论 CD1d基因敲除小鼠拮抗DSS诱导的结肠炎, 可能是通过促进结肠表达NLRP3炎性小体及其底物IL-1beta及IL-18.
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日本血吸虫童虫细胞免疫母鼠的子代抗攻击感染的保护性研究
目的 以2种日本血吸虫易感小鼠为动物模型, 探讨日本血吸虫 (Schistosoma japonicum, S.j) 童虫细胞免疫母鼠的子代鼠抗日本血吸虫攻击感染的应答水平.方法 用S.j童虫细胞分别免疫昆明母鼠和Balb/c母鼠, 将免疫母鼠或正常母鼠与相应鼠种的正常公鼠进行配对饲养, 用其子代鼠建立2个感染模型共4组 (A1:免疫昆明子代感染组;B1:正常昆明子代感染对照组;A2:免疫Balb/c子代感染组;B2:正常Balb/c子代感染对照组);计数A1、B1、A2、B2组经日本血吸虫尾蚴攻击感染后从其子代鼠体内收获的虫荷和每克肝卵荷 (liver eggs per gram, LEPG);测量上述4组小鼠经HE染色后的肝组织切片内虫卵肉芽肿的大小;间接ELISA检测血清中抗S.j可溶性童虫抗原 (soluble juvenile worm antigens, SJWA) IgG (H+L) 水平.结果 与正常昆明株、Balb/c株子代对照组B1、B2组相比, 2组S.j童虫活细胞免疫母鼠子代A1、A2组均表现出不同程度的抗攻击感染的免疫力, 尤其抗生殖效果显得尤为突出.其中, A1获得35.6％的减虫率和59.4％的LEPG减卵率;A2获得29.8％的减虫率和47.4％的LEPG减少率.从肝脏外表来看, B1、B2组子代对照鼠肝脏的坏死程度明显高于A1、A2免疫子代鼠.此外, A1组肝脏虫卵肉芽肿平均直径和面积比B1组分别减少23.8％和43.4％, A2组肝脏虫卵肉芽肿平均直径和面积较B2组减少28.4％和50.3％.A1、A2与B1、B2各指标结果的组间差异均具有统计学意义 (P＜0.05) .间接ELISA结果显示, 不同时间点采集的2株免疫子代鼠血清中的抗SJWA-IgG水平高于同期相应对照组血清中的特异性IgG水平.结论 用S.j童虫细胞接种母鼠所诱生的保护性免疫能传给子代, 进而使子代鼠产生针对后天初次感染的保护性免疫.
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IL-33亚型肝癌稳定转染细胞系的构建及体外生物学功能检测
目的 构建小鼠全长IL-33、分泌型IL-33、入核型IL-33肝癌细胞的稳转细胞系并检测其对肝癌细胞增殖、凋亡、细胞周期的影响.方法 通过PCR的方法克隆小鼠全长IL-33、分泌型IL-33、入核型IL-33基因并将其连接到慢病毒载体pRRL-Venus中.利用293T细胞包装慢病毒并分别感染小鼠肝癌细胞系hepa1-6, 经流式分选单个YFP阳性细胞, 培养得到稳定表达全长、分泌型、入核型IL-33的hepa1-6稳转细胞系.通过一系列体外实验研究小鼠全长, 分泌型, 入核型IL-33对hepa1-6细胞生物学功能的作用.包括CCK8检测细胞增殖, Annexin V和7AAD的流式染色检测细胞凋亡, PI流式染色检测细胞周期.结果 成功克隆了小鼠全长IL-33、分泌型IL-33、入核型IL-33基因并成功构建了hepa1-6稳转细胞系;全长IL-33促进肝癌细胞增殖, 分泌型和入核型IL-33抑制肝癌细胞增殖;全长IL-33能够抑制早期和晚期细胞凋亡, 分泌型IL-33对细胞凋亡无明显影响, 入核型IL-33对早期的细胞凋亡没有作用, 但是能够抑制晚期的细胞凋亡.分泌型IL-33稳转hepa1-6细胞的细胞周期G1期比例增加, 而小鼠全长IL-33和入核型IL-33对hepa1-6稳转细胞的细胞周期均无明显作用.结论 成功构建了小鼠全长IL-33、分泌型IL-33、入核型IL-33 hepa1-6稳转细胞系;小鼠全长IL-33促进肝癌细胞生长, 抑制肝癌细胞的凋亡;分泌型和入核型IL-33均能抑制肝癌细胞的增殖;分泌型IL-33稳转细胞增加G1期细胞比例, 入核型IL-33抑制晚期细胞凋亡.这些结果为进一步研究全长IL-33、分泌型IL-33、入核型IL-33在肝细胞肝癌发展中的作用及其机制奠定了基础.
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欧前胡素通过p38MAPK/NF-κB途径改善哮喘小鼠气道炎症
目的 探究欧前胡素对哮喘小鼠气道炎症的影响, 其机制是否与p38MAPK/NF-κB信号通路有关.方法 将50只雌性Balb/c小鼠进行随机分组并建立OVA诱导的小鼠哮喘模型, 分别用30 mg/kg和10 mg/kg欧前胡素及0.5 mg/kg地塞米松治疗, 对照组用生理盐水代替.末次激发24 h后处死小鼠, 取肺泡灌洗液及肺组织备用.行HE、PAS、Masson染色观察小鼠肺组织病理学变化;Diff-Quick染色对小鼠BALF中的细胞进行分类和计数;ELISA法检测小鼠BALF中IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ的含量;免疫组织化学染色观察p-p38MAPK及NF-κBp65的表达量;Western blot对肺组织中p-p38MAPK及NF-κBp65的含量进行定量分析.结果 欧前胡素能显著抑制小鼠肺组织中的炎性细胞浸润、黏液分泌和杯状细胞的增生以及胶原沉积;减少BALF中炎症细胞数量, 并降低小鼠BALF中IL-4、IL-5、IL-13的含量同时增加IFN-γ含量;欧前胡素也能抑制p38MAPK的磷酸化, 进而抑制NF-κB的表达和活化.结论 欧前胡素能抑制哮喘小鼠的气道炎症, 其机制可能与p38MAPK/NF-κB信号传导通路有关.
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荔枝草乙酸乙酯提取物对LPS诱导的RAW264.7细胞抗炎作用及相关机制研究
目的 在荔枝草抗炎有效部位筛选的基础上, 深入研究荔枝草乙酸乙酯提取物 (LZC) 体外抗炎的作用及相关机制, 为荔枝草的临床开发利用提供实验数据和理论依据.方法 以脂多糖 (LPS) 刺激小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7建立炎症模型, 检测LZC对该炎症模型释放的炎症因子以及炎症信号通路TLR4/MyD88/NF-κB中关键基因表达的影响.结果 荔枝草乙酸乙酯提取物在6.25～25μg/ml范围内, 可显著抑制LPS刺激的RAW 264.7细胞炎症因子PGE2、NO、TNF-α和IL-6的释放水平, 且具有量效关系.进一步研究结果显示, 荔枝草乙酸乙酯提取物也能显著抑制TLR4、MyD88和NF-κBp65蛋白和mRNA水平的表达.结论 荔枝草乙酸乙酯提取物可通过TLR4信号通路减少炎症相关因子的释放从而发挥抗炎的作用.
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干扰IL-8表达对乳腺癌细胞侵袭、迁移能力的影响
目的 探究IL-8对乳腺癌MDA-MB-231细胞生物学特性的影响以及作用机制.方法 将siRNA IL-8转染至乳腺癌细胞中, 实验分为空白对照组、阴性对照组、siRNA1 IL-8组、siRNA2 IL-8组.噻唑蓝 (MTT) 实验观察干扰IL-8基因表达对细胞活力的影响, Transwell小室法检测细胞侵袭、迁移能力的变化, 采用荧光定量PCR (RT-PCR) 和酶联免疫吸附测定法 (ELISA) 检测转染后IL-8 mRNA和蛋白水平, 蛋白质印迹法 (Western blot) 法检测Wnt/β-catenin信号通路的变化.结果 与空白对照组相比, siRNA1 IL-8组、siRNA2 IL-8组乳腺癌细胞中IL-8 mRNA和蛋白表达量显著下降 (P＜0.05);siRNA2 IL-8组细胞中IL-8 mRNA和蛋白水平较siRNA1 IL-8组显著下调 (P＜0.05), 表明siRNA2 IL-8的干扰效果较强, 因此用于后续实验.干扰IL-8表达对抑制乳腺癌细胞的活力无显著影响, 抑制其侵袭、迁移能力 (P＜0.05), 细胞中β-catenin、MMP-2、MMP-9的蛋白水平显著降低 (P＜0.05) .结论 干扰IL-8表达可能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路从而抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭、迁移能力.
关键词： IL-8 侵袭 乳腺癌 Wnt/β-catenin -
白细胞介素-22预处理对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌系统性感染小鼠肝脏炎症应答的影响
目的 在耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)系统性感染小鼠模型中,观察白细胞介素(interleukin)-22预处理对小鼠肝脏组织炎症应答的影响.方法 于感染前24 h对Balb/c小鼠经尾静脉注射25 μg重组小鼠IL-22,7×1010CFU/kg的MRSA(ATCC43300)经尾静脉注射感染小鼠,感染6h后取外周血和肝脏组织.检测血清中谷氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)和7种促炎因子[包括:IL-1β、IL-12p70、干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)、IL-6、趋化因子CXCL1、IL-10、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)]的表达水平;实时定量PCR法检测小鼠肝脏中IFN-γ、IL-6、CXCL1和TNF-d mRNA的水平;对小鼠肝脏组织进行HE染色,观察肝细胞坏死和炎症细胞浸润情况,对组织切片进行病理学评分;分离小鼠肝脏内淋巴细胞(intrahepatic lymphocytes,IHLs),应用流式细胞术检测不同炎症细胞亚群的数量.结果 MRSA感染小鼠血清和肝脏中IFN-γ、IL-6、CXCL1和TNF-α的表达水平均较空白对照组显著升高(P＜0.05),IL-22预处理可降低MRSA感染所致的上述细胞因子升高表达(P＜0.05).MRSA感染亦可导致肝脏炎症损伤,主要表现为血清ALT水平升高、肝脏坏死和炎症病理学评分升高以及肝脏内淋巴细胞和各种非特异性炎症细胞向肝脏募集浸润的数量增加.IL-22预处理可降低MRSA感染所致的肝脏炎症损伤,ALT水平下降,病理学评分降低,炎症细胞向肝脏募集浸润的数量亦减少.结论 IL-22预处理降低MRSA系统性感染小鼠肝脏的炎症反应.
关键词： 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 白细胞介素-22 炎症 动物模型 -
人γδT细胞能够识别肿瘤相关蛋白AGR2
目的 筛选人外周血γδ T细胞识别的肿瘤相关蛋白配体,为阐明γδ T细胞的抗原识别机制及抗肿瘤免疫效应机制奠定基础.方法 以3种特异性结合肿瘤的CDR3δ序列合成肽为探针,通过人类全蛋白质组芯片筛选CDR3δ合成肽相互作用的蛋白;流式细胞术检测蛋白在肿瘤细胞系的表达;原核表达纯化肿瘤相关蛋白AGR2(前梯度2蛋白),ELISA验证其与探针肽的结合;固相化包被蛋白,检测人外周血单个核细胞中γδT细胞的活化相关分子的表达;乳酸脱氢酶释放法检测蛋白对γδT细胞体外细胞毒活性的作用.结果 生物素标记的CDR3δ肽,共筛选到与蛋白质组芯片结合的候选蛋白配体共6种,分别是PHF21A、LDB3、SYF2、PPP1R14A、AGR2和SYAP1;流式结果显示AGR2在几种肿瘤细胞系细胞中均有表达,但表达水平不一致;ELISA结果显示GST-AGR2能特异性地结合CDR3δ肽OT3;固相包被GST-AGR2,能显著促进γδ T细胞活化相关分子CD69、CD25的表达;与GST-AGR2预孵育能在体外显著促进γδ T细胞对MDA-MB-231和MCF-7细胞的细胞毒作用.结论 肿瘤相关蛋白AGR2能够在体外促进γδ T细胞的活化,增强γδ T细胞对乳腺癌细胞的细胞毒活性,可能是γδ T细胞识别的肿瘤相关蛋白配体.
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MCMV早期感染对小鼠CD8+T、γδT和NK细胞功能的影响
目的 通过体内和体外实验观察小鼠巨细胞病毒(murine cytomegalovirus,MCMV)早期感染对小鼠脾脏CD8+T、γδT和NK细胞亚群和功能变化的影响,以将感染增强免疫细胞功能的方法作为提高机体抗肿瘤免疫效应途径的理论基础.方法 分别用5×104 PFU(A组)、5×105 PFU(B组)MCMV和无菌PBS(C组)腹腔注射小鼠,体内感染9d;用1×104 PFU(D组)、1×105PFU(E组)和1×106 PFU(F组)MCMV感染离体小鼠脾脏淋巴细胞24 h和48 h,同时设置空白对照组(G组).多色流式细胞术检测脾脏淋巴细胞表型和功能,ELISA检测体内感染组IFN-γ、IL-2和颗粒酶B的水平.结果 与C组比较,MCMV体内感染小鼠后,MCMV特异性CTL,B组CD8+T细胞分泌的IFN-γ、IL-2和表达的颗粒酶B,A、B组γδT细胞表达的颗粒酶B、CD107a,B组NK细胞表达的CD107a水平均增加;A、B组未成熟NK细胞数减少,但成熟1阶段NK细胞明显增加;以上指标在A、B组间均无差异.ELISA结果提示A、B组IFN-γ、IL-2和颗粒酶B水平均较C组升高,且随病毒滴度增加而升高.与G组相比,体外感染24 h和48 h后D、E、F组CD8+T细胞表达的CD69,24h后CD4+T细胞表达的CD69,24 h后F组CD8+T细胞分泌的IFN-γ,24 h和48 h后各感染组CD8+T细胞分泌的TNF-α以及24 h后D、E组CD4+T细胞分泌的TNF-α均增加,CD8+T细胞和CD4+T细胞各组间IL-2分泌和颗粒酶表达未见明显差异;与G相比,体外感染24 h和48 h后各感染组均可见NK细胞IL-2和颗粒酶B水平升高;以上表面分子、细胞因子和颗粒酶B的表达水平普遍随着病毒滴度的增加而升高.结论 MCMV早期感染后CD8+T、γδT和NK细胞功能可能较前增强,这将为抗肿瘤免疫治疗提供理论基础.
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心房钠尿肽下调呼吸道合胞病毒毛细支气管炎小鼠肺组织T-bet水平
目的 研究T-bet在呼吸道合胞病毒毛细支气管炎小鼠肺组织中的表达及心房钠尿肽刺激下T-bet的变化.方法 建立毛细支气管炎小鼠模型,观察心房钠尿肽的变化;同时利用肺组织病理学、ELISA法和实时定量PCR法检测心房钠尿肽干预后气道炎症浸润、T-bet mRNA及蛋白的表达和IFN-γ等的变化.结果 与正常对照组相比,呼吸道合胞病毒组小鼠肺组织中心房钠尿肽水平明显升高;而经鼻吸入心房钠尿肽可使气道炎症细胞浸润加剧,T-bet及IFN-γ表达水平均降低;而利用心房钠尿肽拮剂预处理后,心房钠尿肽的上述效应可被明显逆转.结论 心房钠尿肽在毛细支气管炎肺组织中存在一定量的表达,同时可下调T-bet水平.
