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胚胎中脑细胞微团培养评价饮用水中有机物致畸性
随着城镇化和工农业的发展,饮用水中有机物污染已成为公共卫生领域的研究热点,特别是饮用水中的氯化消毒副产物(disinfection by-products,DBPs),流行病学及毒理学研究表明这些污染物可致多种畸性[1-5].
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二氯乙酸对胎鼠中脑细胞增殖和分化的影响
氯化消毒已经成为世界各国多年来饮用水的主要消毒过程.近,大量的毒理学实验和流行病学调查结果提示,氯化消毒副产物(chlorination disinfection by-products,DBPs)对低出生体重、早产、自发性流产、死胎以及中枢神经系统均具有不同程度的损害[1].而二氯乙酸(dichloroacetic acid,DCAA)作为DBPs中非挥发性氯化副产物的主要指标,其对神经管和颅面发育损伤及透发心脏畸形具有直接的影响[2].为此,我们采用大鼠胚胎中脑神经细胞微团培养技术[3],观察DCAA对分化期神经元细胞集落形成的影响,通过细胞增殖和分化测定结果来判断DCAA的致畸作用,为进一步阐明氯化消毒饮用水中DBPs的潜在发育毒性及致畸性作用机制提供实验依据.
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碱性橙Ⅱ对大鼠胚胎肢芽细胞增殖和分化的影响
目的 探讨碱性橙Ⅱ对13日龄SD大鼠胚胎肢芽细胞增殖和分化的影响.方法 分离13日龄SD大鼠胚胎肢芽细胞进行微团培养,不同浓度的碱性橙Ⅱ(0.0、12.5、25.0、50.0、100.0、200.0和400.0 mg/L)作用于肢芽细胞,采用CCK8试剂盒检测碱性橙Ⅱ对细胞增殖的影响,采用阿利新蓝8GX染色方法检测碱性橙Ⅱ对肢芽细胞分化的影响.结果 随着碱性橙Ⅱ染毒浓度的增加,胚胎肢芽细胞分化为软骨细胞集落数逐渐减少,细胞增殖率下降,均具有较明显的剂量-效应关系(r细胞毒性=0.958,r细胞分化=0.946);碱性橙Ⅱ对肢芽细胞的半数增殖抑制浓度(pID50)和半数分化抑制浓度(dID50)分别为240.6和69.3 mg/L,对细胞分化的抑制作用大于对增殖的抑制作用.结论 碱性橙Ⅱ对胚胎肢芽细胞的增殖和分化有抑制作用,可能对大鼠胚胎具有潜在的发育毒性.
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采用微团培养技术探讨双酚A的体外发育毒性
采用微团培养观察了不同浓度的双酚A(0～50mg/L)对体外培养的Wistar大鼠胚胎肢芽细胞增殖和分化的影响,旨在了解双酚A的体外发育毒性特点及其可能的作用机制.结果显示:双酚A对体外培养的Wistar大鼠胚胎肢芽细胞的增殖和分化均有抑制作用,表现为染毒组肢芽细胞集落形成数量减少,细胞毒性试验吸光度值下降,并呈现出明显的剂量-反应关系.双酚A对肢芽细胞的50%增殖抑制浓度(IP50)和50%分化抑制浓度(ID50)分别为38.74mg/L 和27.93mg/L,IP50/ID50=1.39.按照Renault等人推荐的体外致畸分类标准,双酚A属于阳性致畸物,对肢芽细胞的分化和增殖有特异性抑制作用.
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乙醇对小鼠胚胎脑发育毒性的体外实验研究
目的探讨乙醇的脑发育毒性及其可能的作用机制. 方法采用植入后全胚胎培养(whole embryo culture,WEC)和微团培养技术. 结果全胚胎培养结果显示,随着乙醇浓度的增加(1.00,2.00,4.00 g/L),胚胎脑畸形率明显上升,呈剂量反应关系,常见的脑畸形为脑神经管未闭.中脑细胞微团培养结果表明,随着染毒剂量的增加,不同浓度乙醇(1.00～16.00 g/L)对中脑细胞的增殖和分化有明显的抑制作用,呈剂量反应关系,ID50(50 %细胞分化抑制浓度)、IP50(50 %细胞增殖抑制浓度)分别为8.89 g/L和12.21 g/L. 结论乙醇抑制胚胎脑细胞的增殖和分化可能是器官形成期乙醇脑发育毒作用的重要机制之一.
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酒精对小鼠神经母细胞发育的影响
目的探讨酒精对胚胎神经母细胞发育的影响及其与畸形发生之间的联系.方法从12 d龄、体节数34～36的小鼠胚胎分离中脑神经母细胞接种培养板,给予不同剂量的酒精于体外连续培养5 d后,检测酒精对细胞增殖和分化的影响,及其线粒体膜电位的变化和细胞凋亡情况.结果酒精对中脑神经母细胞增殖和分化均有抑制作用,其分化抑制剂量(ID50)和增殖抑制剂量(IP5o)分别为210.29 mM和336.55 mM,分化比增殖更敏感.随酒精染毒剂量的增加,细胞线粒体膜电位呈下降趋势,凋亡和坏死细胞数量逐渐增加,存在剂量-反应关系.结论酒精可能通过抑制发育期神经母细胞的增殖和分化以及诱导细胞过度凋亡和死亡而导致中枢神经系统畸形的发生.
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对-壬基酚对大鼠胚胎肢芽细胞增殖和分化的影响
目的了解对-壬基酚(p-NP)的体外发育毒性特点,为揭示对-壬基酚的发育毒性作用机制提供实验依据.方法采用微团培养观察不同浓度的对-壬基酚(0～17.5 mg/L)对体外培养的Wistar大鼠胚胎肢芽细胞增殖和分化的影响.结果对-壬基酚对大鼠胚胎肢芽细胞的增殖和分化均有抑制作用,表现为染毒组肢芽细胞集落形成率降低,细胞毒性试验吸光度值下降,并有明显的剂量-反应关系.对-壬基酚对肢芽细胞的50%增殖抑制浓度(IP50)和50%分化抑制浓度(IP50)分别为15.85 mg/L和11.86 mg/L,IP50/ID50=1.34.结论按照Renault等人推荐的体外致畸分类标准,对-壬基酚属于阳性致畸物,对大鼠胚胎肢芽细胞的分化和增殖均有特异性抑制作用.
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羟基脲对大鼠胚胎的肢芽和中脑细胞增殖和分化的影响
目的 观察羟基脲(抗肿瘤药)对大鼠胚胎细胞增殖和分化的影响.方法 用大鼠胚胎的中脑和肢芽细胞,用微团培养法观察不同浓度的羟基脲对其增殖和分化的影响.结果 羟基脲对中脑细胞和肢芽细胞的半数增殖抑制浓度(IV50)分别为5.90、2.48μg穖L-1,半数分化抑制浓度(ID50)分别为2.01、0.67μg穖L-1.羟基脲对胚胎中脑和肢芽细胞增殖和分化具有明显的抑制作用,且呈剂量-反应关系.结论 羟基脲对发育期神经母细胞和肢芽细胞的增殖和分化均具有抑制作用,可能是羟基脲导致中枢神经系统和四肢畸形的作用机制之一.
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肢芽细胞微团培养评价饮水中有机物致畸性
目的应用大鼠肢芽细胞微团培养技术快速评价饮用水中有机物的致畸性,并比较氯化消毒过程对致畸作用的影响.方法XAD-4树脂富集、浓缩饮用水中有机物,连续5 d微团培养d13大鼠肢芽细胞,根据半数分化抑制浓度(ID50)和半数增殖抑制浓度(IP50)及IP50/ID50比值判定有机浓集物的致畸性.结果在较低剂量范围内,管网末梢水中有机物对大鼠肢芽细胞的分化有明显的抑制作用,ID50分别为363.1 ml/ml(-S9)和5.67 ml/ml(+S9);IP50分别为1355.2 ml/ml(-S9)和1264.5 ml/ml(+S9),IP50/ID50=3.7(-S9);IP50/ID50=223(+S9),显示该组分特异性抑制肢芽细胞的分化,经代谢转化后其ID50降低达63倍;原水中有机浓集物的ID50分别为1.17 ml/ml(-S9)和0.387 ml/ml(+S9);IP50分别为15.8 ml/ml(-S9)和41.1 ml/ml(+S9);IP50/ID50=13.5(-S9);IP50/ID50=106.2(+S9),代谢活化增加该组分的抑制分化作用.结论管网末梢水及原水中有机浓集物属特异性细胞分化抑制物,具有潜在的直接和间接致畸性,为潜在的强致畸原,显示多种致畸机制.氯化消毒过程可能增加饮用水中有机物的间接致畸作用.
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稳恒磁场对大鼠胚胎肢芽细胞增殖和分化的影响
利用大鼠胚胎肢芽细胞进行原代培养,培养物经不同强度的稳恒磁场作用,研究稳恒磁场对增殖和分化的影响,并利用图象分析细胞形态的变化.结果显示强度大于40mT的稳恒磁场能明显抑制肢芽细胞增殖和分化,集落形成率明显减少,并显示剂量效应关系.拟合细胞分化和增殖抑制曲线,计算得大鼠胚胎肢芽细胞半数分化抑制强度(ICD50)为52mT,半数存活抑制强度(ICV50)为40mT.表明抑制细胞分化、增殖可能是稳恒磁场致发育危害的重要作用.
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补肾活血方含药血清对小鼠肢芽细胞增殖和分化的影响
目的 探讨补肾活血方对小鼠肢芽细胞向软骨细胞分化增殖的影响.方法 分离12.5天小鼠胚胎肢芽细胞进行微团培养,同时用补肾活血方含药血清进行干预.采用MTT法检测肢芽细胞的增殖活性,阿尔新蓝染色检测肢芽细胞分化为软骨细胞能力,RT-PCR法检测肢芽细胞中Col2a1、Col10al、Mmp9、β-catenin、Runx2 mRNA的表达水平.结果 与空白对照组比较,补肾活血方含药血清组在24 h、48 h和72h3个时间点均能显著促进小鼠肢芽细胞增殖.微团培养6d后,阿尔新蓝染色结果显示补肾活血方含药血清组软骨细胞集落形成增加.RT-PCR结果显示补肾活血方含药血清组肢芽细胞Col2al mRNA表达水平增加,而Coll0al、Mmp9、β-catenin、Runx2 mRNA表达下调.结论 补肾活血方含药血清可能通过β-catenin信号通路促进小鼠胚胎肢芽细胞的增殖与分化.
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生长分化因子5诱导人骨髓间充质干细胞微团成软骨分化的研究
[目的]探讨应用生长分化因子5(growth differentiation factor5,GDF-5)诱导人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells,hMSCs)微团成软骨分化的可行性及效果.[方法]体外分离培养hMSCs,取第3代细胞实验.将hMSCs分别用无血清H-DMEM和含10、20、50、100ng/ml GDF-5的软骨诱导液(chondrogenic medium,CM)诱导,显微镜下观察细胞形态变化,MTT法检测各组细胞的增殖情况.诱导2周后重悬细胞,以5×106/ml的细胞密度离心构建微团,继续诱导2周.RT-PCR检测两组细胞Ⅱ型胶原mRNA的表达.免疫组化、甲苯胺蓝染色检测Ⅱ型胶原和蛋白多糖表达.[结果]hMSCs呈梭形、漩涡状生长.100ng/ml GDF-5诱导的hMSCs呈圆形或多角形.五组微团分别由无血清H-DMEM、含10,20,50,100ng/ml GDF-5的软骨诱导液诱导2周后,除H-DMEM组无Ⅱ型胶原mRNA、Ⅱ型胶原蛋白和蛋白多糖的表达外,其他各组Ⅱ型胶原mRNA、Ⅱ型胶原蛋白和蛋白多糖的表达呈浓度依赖性增加,各组差异均有统计学意义(P＜0.05).[结论]经一定浓度GDF-5诱导的hM-SCs微团,Ⅱ型胶原和蛋白多糖表达呈浓度依赖性增加,具有软骨的部分生物学功能.
关键词： 成人骨髓间充质干细胞 生长分化因子5 微团培养 软骨分化 -
低频电磁场干预大鼠骨髓间充质干细胞体外成软骨分化的研究
目的 探讨在体外条件下低频电磁场诱导大鼠骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的可行性.方法 大鼠骨髓间充质于细胞传代至第5代后,采用微团培养法在含成纤维生长因子-2和转化生长因子-β3的培养基中生长,并给予正弦波电磁场(1.0 mT,50 Hz)干预.3周后进行阿利新蓝染色以检测软骨基质生成量,采用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)技术检测软骨特异性蛋白的基因表达水平,并使用二甲基-亚甲蓝(DMMB)染料结合法评估细胞微团中糖胺多糖水平.结果 在电磁场和生长因子的协同作用下,大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)细胞微团向软骨分化,细胞微团中Ⅱ型、X型胶原及蛋白多糖基因表达水平显著增加,而性别决定区Y框蛋白9(SOX9)的表达没有明显变化.与非暴磁组比较,暴磁组细胞糖胺多糖(GAG)/DNA比例较高(3.108±0.341).结论 电磁场促进大鼠BMSCs成软骨分化可能与细胞表达Ⅱ、X型胶原及糖胺多糖增多有关.电磁场在生长因子的协同作用下可诱导及维持间充质干细胞成软骨分化,但单因素电磁场刺激不能诱导大鼠骨髓间充质干细胞成软骨分化.
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淫羊藿苷促进入骨髓间充质干细胞成软骨分化的研究
目的 探讨应用淫羊藿苷促进人骨髓间充质干细胞(hMSCs)成软骨分化的可行性及效果.方法 体外分离培养hMSCs,取第3代细胞实验.将hMSCs分别用无血清高糖培养基(H-DMEM)和含1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5mol/L淫羊藿苷的软骨诱导液(CM)诱导,显微镜下观察细胞形态变化,噻唑蓝(MTT)法检测各组细胞的增殖.以5×109/L的细胞密度离心构建微团,诱导培养3周.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测各组蛋白多糖和Ⅱ型胶原mRNA的表达.免疫组织化学、甲苯胺蓝染色检测Ⅱ型胶原和蛋白多糖表达.结果 5组微团分别由无血清H-DMEM、含1 × 10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5mol/L淫羊藿苷的CM诱导3周后,除H-DMEM组无Ⅱ型胶原和蛋白多糖表达外,其他各组Ⅱ型胶原蛋白和蛋白多糖的表达呈浓度依赖性增加,ImagePro Plus 6.0软件测得各组Ⅱ型胶原平均吸光度(A)值分别为0.0214±0.0035、0.1182 ±0.0105、0.1886 ±0.0184、0.2903±0.0261、0.3476±0.0287,各组差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 淫羊藿苷能促进hMSCs成软骨分化,软骨分化程度呈浓度依赖性增加.
关键词： 成人骨髓间充质干细胞 淫羊藿苷 微团培养 软骨分化 -
锌对小鼠胚胎肢芽细胞分化和增殖的影响
目的观察锌缺乏与锌过量对小鼠胚胎肢芽细胞分化的影响及其毒性作用.方法取12天龄昆明种小鼠胚胎的肢芽,应用微团培养技术,观察不同剂量的锌对肢芽细胞分化和增殖的影响.结果培养基中锌缺乏时或者培养基锌浓度达42 μmol/L时,均可明显抑制细胞分化和增殖(P《0.01).当培养基锌浓度为21 μmol/L或28 μmol/L时,对肢芽细胞分化和增殖均具有明显的促进作用,而锌浓度达35 μmol/L时,对细胞分化的促进作用转化为抑制作用但不影响细胞的存活.结论体外实验条件下,锌对小鼠胚胎肢芽细胞的分化和增殖表现为促进和抑制双重作用;缺锌及过量锌均可抑制细胞的分化并产生毒性作用.
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苯对小鼠胚胎肢芽和中脑细胞分化与增殖的影响
目的 探讨苯对胚胎肢芽、中脑细胞分化和增殖的影响及对肢芽器官发育的影响.方法 分离12d龄小鼠胚胎肢芽和中脑细胞进行微团培养,观察肢芽和中脑细胞的分化与增殖;结果 随着苯染毒浓度的增加,胚胎肢芽细胞分化为软骨细胞的集落数逐渐减少,中脑细胞形成神经集落数减少、体积小,集落细胞间突起数量减少,肢芽细胞和中脑细胞增殖率下降,均具有较明显的剂量-效应关系;苯对肢芽细胞的半数分化抑制浓度(dID50)和半数增殖抑制浓度(pID50)分别为89.93μmol/L和396.77μmol/L,对中脑细胞的dID50和pID50分别为116.29μmol/L和831.46μmol/L,对细胞分化的抑制作用大于对增殖的抑制作用.结论 苯对胚胎中脑及肢芽细胞的分化和增殖有特异性抑制作用,可能对胚胎骨和脑具有发育毒性.
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应用中脑细胞微团培养技术探讨双酚A的发育毒性
目的为揭示双酚A(BPA)是否具有神经系统发育毒性及其毒作用机制提供实验依据.方法采用微团培养技术观察不同浓度的BPA(0～60 mg/L)对体外培养的13 d龄Wistar大鼠胚胎中脑细胞分化的影响及其细胞毒性作用.结果 BPA对体外培养的大鼠胚胎中脑细胞的存活和分化均有抑制作用并呈现出明显的剂量反应关系.BPA对中脑细胞的50%细胞存活抑制浓度(ICV50)和50%分化抑制浓度(ICD50)分别为57.2 mg/L和24.6 mg/L.两者比值为2.33.结论 BPA对大鼠胚胎中脑细胞分化的抑制作用大于对细胞存活的抑制作用.按照Flint等人推荐的体外致畸分类标准,BPA属于阳性致畸物.
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硫酸铝钾对胎鼠肢芽细胞增殖和分化的影响
目的 研究硫酸铝钾对胎鼠肢芽细胞的增殖和分化的影响.方法 应用微团培养法探讨不同浓度铝(0～100 μmol/L)对体外培养的小鼠胚胎肢芽细胞增殖和分化的影响.结果 铝对肢芽细胞的50%增殖抑制浓度(IP50)和50%分化抑制浓度(ID50)分别为45.97和3.60 μmol/L,IP50/ID50值为12.8,并有明显的剂量―反应关系.结论 硫酸铝钾对胎鼠肢芽细胞的增殖和分化可能有抑制作用.
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细胞骨架结构改变对软骨细胞表型的影响
目的:分析细胞骨架结构改变对软骨细胞表型的影响.方法:二维及三维微团培养兔膝关节软骨细胞,分别破坏软骨细胞骨架的微管、肌动蛋白及波形蛋白,分析细胞骨架改变引起软骨细胞表型改变的关系.结果:破坏软骨细胞骨架的波形蛋白,可引起Ⅱ型胶原蛋白及蛋白聚糖表达下降,且三维微团培养较二维培养下降更明显,而Ⅰ型胶原蛋白表达则无明显改变:破坏软骨细胞骨架的微管,不引起Ⅰ型胶原蛋白、Ⅱ型胶原蛋白及蛋白聚糖表达的改变;破坏软骨细胞骨架的肌动蛋白,在二维培养条件下可促进Ⅱ型胶原蛋白的表达,而在三维微团培养条件下,Ⅱ型胶原蛋白表达则无明显改变.结论:波形蛋白对维持正常软骨细胞表型起重要作用.
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调节软骨细胞骨架蛋白对成软骨表型的影响
目的 研究软骨细胞骨架蛋白结构改变与成软骨细胞表型改变的关系.方法 采用三维微团培养法培养新西兰兔膝关节软骨细胞,将软骨细胞分为对照组、秋水仙碱组、细胞松弛素B组及丙烯酰胺组,通过秋水仙碱、细胞松弛素B及丙烯酰胺分别调节软骨细胞骨架的微管、肌动蛋白微丝及波形蛋白中间纤丝,从大体形态、组织切片染色、免疫组化染色及RT-PCR分析成软骨细胞表型的改变.结果 对照组、秋水仙碱组及细胞松弛素B组细胞较密集、均一,丙烯酰胺组细胞较少、分散.对照组、秋水仙碱组及细胞松弛素B组COLⅡ、蛋白多糖染色深,COL Ⅰ染色浅;而丙烯酰胺组COLⅡ、蛋白多糖染色浅,COL Ⅰ染色较深.RT-PCR数据统计分析显示对照组与秋水仙碱组、细胞松弛素B组相比,COL Ⅰ(1.21 ±0.21 vs 1.55 ±0.06、1.70±0.07)及COLⅡ(1.10 ±0.12vs0.91 ±0.21、0.90 ±0.30)表达差异无统计学意义(P＞0.05);而对照组COLⅡ表达明显多于丙烯酰胺组(0.26 ±0.06),COL Ⅰ表达明显低于丙烯酰胺组(9.63±0.38),差异有统计学意义(P＜0.05).结论 丙烯酰胺调节软骨细胞骨架波形蛋白中间纤丝可明显下调COLⅡ、蛋白多糖的表达.
