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3种抗氧化剂对染尘大鼠DNA链断裂的影响
暴露于矽尘能导致以肺纤维化为主的全身性疾病.大量研究表明肺泡巨噬细胞(AM)在抵御矽尘入侵的过程中起着十分重要的作用,矽尘可以损伤巨噬细胞膜、介导细胞凋亡等[1],但有关矽尘损伤AM DNA的研究报道不多.单细胞凝胶电泳(SCGE)技术是近年发展起来的一种高效、灵敏的检测DNA链断裂的新技术.我们利用此技术检测染尘大鼠AM中DNA链断裂,并探讨茶多酚(TP)、维生素C、维生素E的保护作用.
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平阳霉素对p53基因外显子7的链断裂作用研究
特定基因链断裂与肿瘤的发生发展,以及遗传性疾病等密切相关,其检测具有重要的毒理学理论和实践意义.近,我们建立了非放射性连接介导聚合酶链反应(ligation-mediated polymerase chain reaction,LMPCR)技术,以限制性内切酶消化基因组DNA建立损伤模型,成功检测了p53基因的链断裂[1].
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棒曲霉素引起HEK-293细胞DNA损伤的溶酶体途径
目的 研究棒曲霉素(PAT)引起的DNA损伤与细胞内ROS水平以及溶酶体的关系,探讨PAT遗传毒性的机制.方法 以HEK-293细胞作为试验系统,单细胞凝胶电泳试验检测DNA损伤情况,2’,7’-二氢二氯荧光素检测ROS水平,吖啶橙测定溶酶体膜稳定性;采用NAC和NH4C1对溶酶体进行保护干预;采用NAC、NH4Cl、抑胃肽干预PAT所致的DNA损伤.结果 PAT作用细胞1h,不同浓度引起细胞DNA链断裂、溶酶体膜稳定性改变和ROS水平增加;经NH4Cl、NAC预处理,PAT引起的溶酶体膜稳定性均增强了;经NH4Cl、NAC和抑胃肽干预处理,PAT引起的DNA链断裂几乎完全被阻止.结论 棒曲霉素可致HEK-293细胞DNA链断裂,其作用机制可能与溶酶体途径有关,溶酶体可能是棒曲霉素细胞毒性的生物靶点之一,并由ROS引起溶酶体膜稳定性的破坏.
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镍致DNA链断裂及对聚腺苷二磷酸核糖聚酶活性的影响
目的探讨镍所致DNA链断裂及其所诱导的聚腺苷二磷酸核糖聚酶(PARP)之间的关系.方法培养猴肾Vero细胞,分别用0、125、250、500、1 000 μmol/L的醋酸镍染毒2.5、6和12 h;苔盼蓝计数法检测细胞存活率,单细胞凝胶电泳法检测DNA链断裂,3H掺入法检测PARP活性.结果镍浓度与DNA链断裂程度之间存在剂量-效应和时间-效应关系;镍也可诱导PARP活性显著升高,但在高浓度和长时间染毒时,其活性不再增加.结论镍所致的DNA链断裂与其诱导的PARP活性之间存在特殊关系,这可能与镍的致癌性相关.
关键词： 镍 DNA链断裂 聚腺苷二磷酸核糖聚合酶 -
建立非放射性连接介导PCR技术检测p53基因链断裂
DNA链断裂是一种严重的DNA损伤.它可引起基因突变,DNA重排,染色体结构异常乃至细胞死亡等.在常用的检测方法中,单细胞凝胶电泳技术具有灵敏、快速、简便、直观等优点,本室曾作过系统研究[1].但是,和其他常用方法一样,该技术也不能检测特定基因的DNA链断裂.而一些重要的基因如癌基因和抑癌基因的DNA损伤与致突变-致癌效应的关系非常密切,因此检测这些基因的DNA链断裂可能更有利于阐明链断裂剂的作用特点和机制,具有更加重要的意义.国外有人利用连接介导聚合酶链反应(Ligation-Mediated Polymerase Chain Reaction,LMPCR)技术分析DNA甲基化[2],研究氧化损伤和检测DNA加合物等[3,4].该技术是在碱基修饰位点用酶或化学方法处理把DNA链人为切断,将基因特异性引物延伸至切断点形成钝末端,再与一公共双链连接物连接,然后经PCR放大.根据其原理,我们认为,LMPCR也可直接用于检测DNA链断裂.为了证实这一想法,我们用限制性内切酶建立DNA链断裂模型,完全消化基因组DNA,再用LMPCR法检测p53基因外显子7的链断裂.由于我们使用的内切酶AfaI和MspI在p53基因外显子7上各自只有一个切点,若方法建立成功,分别会有一条特定长度的扩增带出现.
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α辐射诱发人胚肺细胞转化及DNA链断裂
目的探索α辐射所致DNA链断裂损伤与辐射致癌之间的定量关系.方法用缺口翻译技术检测DNA链断裂,用软琼脂克隆形成率评价细胞转化.结果0.25～5Gyα粒子照射后的人胚肺细胞,DNA链断裂损伤和半固体琼脂培养集落形成率均明显增加,并显示出良好的剂量效应关系.进一步分析表明,各受照射组细胞DNA链断裂与细胞转化率之间存在着显著的正相关.结论α辐射致癌与辐射致细胞DNA链断裂损伤密切相关.
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姜黄素拮抗亚砷酸钠所致的DNA链断裂损伤
目的观察姜黄素对亚砷酸钠诱发小鼠体内免疫器官细胞DNA链断裂损伤的拮抗作用.方法用单细胞凝胶电泳法.结果亚砷酸钠单独染毒后的DNA链断裂损伤的高峰期各器官不同,脾脏为染毒后1 h,胸腺和骨髓在染毒后3 h.姜黄素拮抗亚砷酸钠引起的各器官DNA链断裂损伤的作用在高峰期明显,表现为彗星细胞百分比降低,并有量效关系.结论姜黄素可以预防亚砷酸钠诱发的小鼠脾脏、胸腺和骨髓细胞的DNA链断裂损伤.
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菲(口罗)啉对不同氧化剂和多柔比星所致CHL细胞DNA链断裂的影响
目的为了研究菲(口罗)啉对2种氧化剂和抗癌药多柔比星诱发细胞DNA损伤的影响, 并初步探讨其损伤机制.方法用不同浓度菲口罗啉预处理CHL细胞30 min, 再分别加入3种不同染毒受试物,共同培养一定时间(0.3 mmol*L-1重铬酸钾:105 min; 0.5 μmol*L-1多柔比星:75 min; 0.4 mmol*L-1过氧化氢(H2O2):25 min)后, 用碱性单细胞凝胶电泳方法(ASCGE)测定DNA链断裂情况, 并同时以菲口罗啉与二甲亚砜(DMSO,0.33 mol*L-1)比较对H2O2致DNA损伤中*OH的产生和清除.结果 3种染毒受试物均可明显引起CHL细胞DNA链断裂;而当3 μmol*L-1菲口罗啉预处理后, 可使重铬酸钾、H2O2所致DNA迁移长度和细胞拖尾率明显降低, 并超过DMSO降低H2O2的损伤作用, 当菲口罗林浓度升至12 μmol*L-1时, 可完全消除这两种因素所致的DNA链断裂损伤;10 μmol*L-1菲口罗啉可抑制多柔比星所致DNA损伤, 但浓度直至60 μmol*L-1仍不能完全消除多柔比星的损伤作用.结论菲口罗啉对2种氧化剂和多柔比星所致DNA损伤均有不同程度的防护作用,同时提示重铬酸钾和H2O2所致的DNA损伤主要与需过渡金属离子参与的*OH产生有关, 而多柔比星所致损伤仅部分与此有关.
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应用DNA链断裂等指标评价短波辐射对男性生殖功能的影响
目的探讨短波辐射对精液质量产生的影响,提出加强男性生殖保健的预防措施.方法采用单细胞凝胶电泳和精子全自动分析相结合的方法对两组不同职业男性的精液标本进行检测.结果接触短波辐射暴露和未接触短波暴露的正常对照组精液全自动分析各项指标均无异常,但单细胞凝胶电泳中Ⅰ级彗星率即DNA链断裂数量暴露组明显高于对照组.结论单细胞凝胶电泳可用于评价职业和环境对男性精液质量的影响,为临床和卫生防护部门能够早期发现精子亚临床损伤提出科学依据.
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大气可吸入颗粒物致HepG2细胞DNA损伤
目的 研究大气可吸人颗粒物(PM10)致人肝细胞瘤细胞(HepG2)DNA损伤及其可能机制.方法 单细胞凝胶电泳(SCGE)试验检测细胞DNA链断裂;2',7'-二氢二氯荧光素(DCFH)法测定细胞内活性氧水平;免疫组化方法测定8-羟脱氧鸟苷(8-OHdG)在细胞内的表达水平;免疫细胞化学法检测细胞内核转录因子NF-kB p65蛋白表达水平.结果 大连市4个监测点PM10有机提取物致HepG2细胞DNA链断裂作用存在地点和季节差异;7.5～30 μg/mL PM10有机提取物作用HepG2细胞1 h后,尾DNA%增大,呈剂量依赖关系.HepG2细胞与7.5～30μg/mL的PM10有机提取物接触1 h后,可引起细胞内ROS水平表达的明显增加;7.5～30μg/mL的PM10有机提取物作用于HepG2细胞3 h后,细胞内8-OHdG水平的表达增强;HepG2细胞与30 0.μg/mL的PM10有机提取物接触24 h后,NF-KB p65蛋白表达水平明显增高.结论 PM10有机提取物可引起体外HepG2细胞DNA链断裂;DNA链断裂水平随不同季节和不同监测点而异;PM10引起DNA损伤的机制可能是细胞内ROS生成增多,8-OHdG表达增高及NF-kB p65蛋白表达水平升高而导致的氧化性DNA损伤.
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胆红素及牛黄拮抗苯乙烯所致肝癌细胞株损伤
目的观察苯乙烯诱导的人肝癌细胞株(HepG2)细胞DNA链断裂损伤以及天然牛黄和胆红素对其损伤的拮抗效应.方法采用单细胞凝胶电泳法观察HepG2细胞体外暴露于苯乙烯出现的DNA链断裂损伤,同时观察天然牛黄和胆红素对于苯乙烯诱导DNA损伤的拮抗作用.结果在细胞存活未受到苯乙烯影响的浓度下,0.2μmol/L的苯乙烯即可诱导HepG2细胞明显的DNA链断裂损伤,彗星细胞频率和DNA迁移距离分别为(9.5±2.1)%和(4.5±0.7)μm.在明显诱导DNA损伤浓度的苯乙烯处理时同时加入天然牛黄或胆红素,发现二者对苯乙烯诱导的DNA链断裂损伤在一定浓度下均有良好的拮抗作用,10 μmol/L的胆红素或天然牛黄与1μmol/L的苯乙烯共同处理时,HepG2细胞的DNA损伤水平基本回复到本底水平.结论苯乙烯能够诱导HepG2细胞出现DNA链断裂损伤,10 μmol/L的胆红素或天然牛黄基本能完全拮抗苯乙烯诱导的DNA链断裂损伤.
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亚砷酸钠致脏器细胞DNA链断裂的实验研究
目的观察不同剂量亚砷酸钠(NaAsO2)在不同时相引发小鼠体内细胞DNA链断裂损伤的影响.方法采用单细胞凝胶电泳法(SCGE)分别测定ICR小鼠皮下注射NaAsO2 0.4,2,10mg/kg后1,3,6h的脾脏、胸腺、骨髓和肝细胞的DNA链断裂损伤.结果不同剂量亚砷酸钠注射后,可以发现2和10mg/kg NaAsO2可诱发脾细胞、胸腺细胞、骨髓细胞DNA链断裂,各组出现的彗星细胞百分比明显高于对照组,同时DNA迁移距离也较对照组明显增大;而在染毒后不同时相观察的结果表明,NaAsO2诱发脾细胞出现DNA链断裂损伤在1h为明显,而胸腺细胞和骨髓细胞相对较晚,DNA链断裂损伤高峰出现在染毒3h;染毒6h,各种组织细胞的DNA链断裂损伤开始减少,逐渐趋于正常.各剂量组及时间点均未观察到亚砷酸钠有诱导肝细胞DNA链断裂损伤的作用.结论2mg/kg和10mg/kgNaAsO2可诱发小鼠体内脾、胸腺和骨髓细胞的DNA链断裂损伤,但不同细胞对NaAsO2作用的反应性不完全一致.
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五氯酚钠诱导小鼠遗传损伤的研究
目的观察不同剂量五氯酚钠(Na-PCP)在不同处理后引发小鼠体内免疫细胞的DNA链断裂损伤和微核形成作用.方法采用单细胞凝胶电泳法(SCGE)分别测定ICR小鼠灌胃染毒0,25,50和100 mg/kg后3和24h脾细胞、胸腺细胞和巨噬细胞的DNA链断裂损伤.同时观察了连续灌胃染毒1个月,剂量分别为0,6.25,12.5和25 mg/kg时脾细胞DNA链断裂损伤情况;微核试验观察染毒24和48 h骨髓嗜多染红细胞的微核形成.结果在不同剂量五氯酚钠染毒3h后,脾细胞出现DNA链断裂损伤的频率以及迁移距离在50和100 mg/kg组明显高于对照;巨噬细胞在100 mg/kg时出现明显的DNA损伤;但胸腺细胞在研究剂量范围内未见明显变化;染毒24和48 h后,所有观察细胞均未出现明显的DNA链断裂损伤.五氯酚钠处理1个月未诱发脾细胞明显的DNA链断裂损伤.骨髓嗜多染红细胞微核在研究剂量范围内未明显增高.结论100mg/kgNa-PCP可诱发小鼠体内脾脏细胞和巨噬细胞的DNA链断裂损伤,50mg/kg Na-PCP可诱导脾脏细胞DNA链断裂损伤,Na-PCP对胸腺细胞DNA损伤作用不明显:Na-PCP连续1个月作用未诱导脾细胞出现明显的DNA链断裂损伤.25～100mg/kg Na-PCP未诱导骨髓嗜多染红细胞微核增加.
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单细胞凝胶电泳对男性精液质量的评价
目的采用单细胞凝胶电泳的方法评价短波辐射对男性精液质量的影响,早期发现精子的亚临床损伤,及时提出干预措施,保证人口素质真正意义上的提高.方法采用常规精液分析和单细胞凝胶电泳相结合的方法分别检测短波接触者的精液质量,以判断短波辐射对男性生殖功能的影响.结果短波辐射暴露组精液分析无变化,但单细胞凝胶电泳-DNA链断裂分析显示Ⅰ级彗星率明显高于对照组.结论提示长期接受短波辐射人员的精液分析包括精子数量、精子活力和精子活率等影响不大,但可见精子DNA链断裂增多,这种微结构改变即亚临床损伤可通过单细胞凝胶电泳检测出来.
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硫酸铜对小鼠脾细胞DNA损伤研究
[目的]观察不同剂量硫酸铜作用不同时间对小鼠脾细胞DNA链断裂损伤的影响. [方法]采用单细胞凝胶电泳法(SCGE)分别测定小鼠灌胃1次染毒硫酸铜50、100、200mg/kg和连续每天1次灌胃硫酸铜12.5、25.0和50.0mg/kg2周及连续灌胃3、6和12mg/kg 1个月后小鼠脾细胞DNA链断裂损伤情况.各染毒组均没相应的对照组. [结果]50、100和200mg/kg硫酸铜1次染毒;25.0和50.0mg/kg硫酸铜染毒2周;6和12mg/kg硫酸铜染毒1个月后,脾细胞均出现DNA链断裂损伤的频率以及尾长均明显高于对照组. [结论]硫酸铜可引起脾脏细胞明显的DNA链断裂损伤,此损伤作用存在蓄积效应.
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应用精子质量和彗星试验评价铅对男性生殖功能的影响
[目的]探讨铅对精液质量产生的影响,提出加强男性生殖保健的预防措施.[方法]采用单细胞凝胶电泳(彗星试验)和精子全自动分析仪相结合的方法,对铅接触组和未接触铅的对照组男性的精液标本进行检测.[结果]接触组与对照组精液全自动分析各项指标均无异常,但单细胞凝胶电泳中接触组Ⅰ级彗星率即DNA链断裂数量(4.28±2.73)%明显高于对照组(2.73±1.89)%(P＜0.05).[结论]彗星试验可用于评价职业性铅接触对男性精液质量的影响,为临床和卫生防护部门能够早期发现精子亚临床损伤提出科学依据.
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中国仓鼠肺成纤维细胞和HeLa细胞DNA氧化损伤的自身修复能力与比较
目的:研究不同氧化相关因素对中国仓鼠肺成纤维细胞(CHL)和HeLa细胞DNA损伤的自身修复情况.方法:将CHL细胞和HeLa细胞用不同氧化相关因素处理一定时间[CHL细胞:过氧化氢(H2O2)25 min,重铬酸钾(K2Cr2O7)105 min,阿霉素(Dox)75 min;HeLa细胞:H2O2 25 min,K2Cr2O7 105 min],随后立即去毒培养0、0.5、1、2、3 h,以碱性单细胞凝胶电泳技术检测DNA链断裂情况.结果:①CHL细胞经H2O2、K2Cr2O7、Dox作用后引起DNA链断裂,去毒培养1 h链断裂修复明显(P<0.01);去毒培养2～3 h,前两毒剂的损伤组完全修复,而Dox组链断裂仍高于未损伤组;②HeLa细胞经H2O2、K2Cr2O7作用后引起DNA链断裂,去毒培养0.5 h链断裂明显修复(P<0.01),去毒培养1 h则完全修复;③CHL细胞和HeLa细胞损伤后修复的拖尾率与修复时间的回归系数显著不同(P<0.05).结论:两种细胞在氧化性DNA损伤后均迅速启动自身修复,但HeLa细胞比CHL细胞有更快的修复能力;同时这两种细胞由Dox所致损伤修复能力均较H2O2、K2Cr2O7所致的差.
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单细胞凝胶电泳技术的现场应用及健康人群的表现特征
目的 介绍一种改良的单细胞凝胶电泳技术同时检测血白细胞DNA链断裂和DNA-蛋白交联并将其应用于部分健康人群。方法 60名健康人群，每人血样分A、B两份，B份在细胞裂解后加蛋白酶K，其余同常规方法；B份尾矩为总的DNA链断裂量，B份与A份尾矩的差值为DNA-蛋白交联量。结果 DNA链断裂在性别、年龄和饮酒与否方面的分布无显著性差异，而吸烟可使其显著增加；上述各因素对DNA-蛋白交联均无显著影响，后者在该研究人群中的分布呈正态(2.46×10６±0.70×10６)。结论 该研究为职业接触人群DNA损伤的监测提供了方法学和对照数据的参考。
