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Label free方法研究大鼠脑脊液中锰毒性相关的差异蛋白质组
目的 本研究旨在探查临床可介入性生物样本脑脊液中锰毒性相关的差异表达蛋白谱,为今后深入的毒性机制研究和病程相关生物标志研究提供科学数据.方法 运用非标记( label free)定量蛋白质组学技术分析比较成年大鼠经腹腔注射暴露于氯化锰(以锰计,6 mg Mn/kg BW)1个月(亚急性)、3个月(亚慢性)及3个月加30 d恢复期后与其相应对照组(腹腔注射生理盐水)大鼠的脑脊液中蛋白质的差异表达情况,并根据蛋白质的基因本体( gene ontology,GO)注释对所鉴定蛋白进行了分类分析.结果 本研究共鉴定到173个蛋白质,经差异性比较与重复蛋白剔除后获得123个锰毒性相关的差异表达蛋白,其中,染锰后55个蛋白质表达量上调,68个蛋白质表达量下调.根据差异性,123个差异表达蛋白可分为4个层次,分别为表达升高(4个),表达下降(2个),仅在对照组鉴定到(66个),仅在染毒组鉴定到(51个).对123个差异蛋白按其GO注释分别进行细胞组件、分子功能及生物学过程分类后发现,差异表达蛋白主要来自于细胞核、细胞外基质及细胞质,以结合功能为主,少数参与代谢、应对刺激等生物学过程,半数以上的生物学过程未知.结论 由于脑脊液中的蛋白质多数都是由脉络丛组织合成分泌的,因此上述脑脊液中差异表达的蛋白质组不仅可以作为锰神经毒性作用引起的神经退行性疾病的潜在的生物学标志,而且还为锰致脉络丛(血-脑脊液屏障的组织基础)上皮细胞毒性损伤作用分子机制的深入研究提供线索和实验基础.
关键词： 锰 脑脊液 脉络丛 非标记(label free)定量蛋白质组学技术 GO分析 -
大鼠脉络丛组织中锰毒性差异蛋白的筛选、鉴定和GO分析
目的 应用光镜、透射电镜及差异蛋白质组学技术探讨锰对构成血-脑脊液屏障的脑脉络从组织(choroidplexus,CP)的病理损伤作用及其差异表达蛋白,并对这些差异蛋白按其gene ontology(GO)注释进行细胞学组分、分子功能与生物学过程的分类分析.方法 采用雄性SD大鼠(1.5月龄)进行腹腔注射无水氯化锰(6 mg Mn/kg B·W)建立3个病程(30、90 d及90 d后无处理观察30 d)的锰中毒动物模型,分离其双侧侧脑室CP后,应用光镜与透射电镜观察锰所引起的CP病理形态学改变,同时应用蛋白质组学技术筛检出锰毒性相关的差异表达蛋白.结果 病理形态学观察发现锰可引起CP上皮细胞发生不规则萎缩变小,微绒毛结构紊乱、缩短,胞浆内出现空泡,核质凝聚,线粒体结构破坏,细胞之间的紧密连接出现部分断裂或消失等,并且这些改变随病程发展表现为加重的趋势;2D-PAGE结合nano-LC-MS/MS的办法鉴定到了32个锰病程相关的差异蛋白质,其中有27个上调蛋白,5个下调蛋白.GO分类分析后发现差异表达蛋白主要分布存线粒体、膜表面以及细胞质内,以结合、催化活性以及转运功能为主,参与代谢与转运等生物学过程.结论 锰可引起CP的细胞及亚细胞结构发生病理性损伤并表现为一定的时效性,即便停止锰染毒上述损伤仍然进行性加重;同时,还可造成CP中特定功能蛋白质随病程进展发生上调或下调的变化,这些改变很可能是锰引起BCB结构损伤和功能失调的分子基础,其功能蛋白质组学的研究值得进一步深入开展.
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miR-29a和miR-142-3p促进髓系分化的基因调控网络
目的 深入了解miR-29a/miR-142-3p参与促进髓系分化的调控网络.方法 首先实现miR-29a和miR-142-3p在HL-60细胞中的过表达,同时使用PMA以及ATRA分别诱导HL-60细胞向单核及粒系分化.May-Grünwald-Giemsa染色方法观察核形态变化,Real-time PCR检测细胞内CD11和CD14的表达.mRNA表达谱芯片分析获得表达模式相似的基因,利用DAVID和GeneMANIA进行GO categories和信号通路归类分析.PicTar和TargetScan进行靶基因预测,双荧光报告基因实验确定靶基因的真实性.结果 miR-29a/miR-142-3p过表达细胞与PMA/ATRA诱导分化细胞在整体基因表达模式上有较高的相似度,而表达模式相似的基因大多与细胞分化相关,且在GO分析中显著富集.同时,ZBTB5、CaMKK2、SUV420H2、TRIB2和CANX被确定为miR-29a新的靶基因.结论 miR-29a/miR-142-3p通过调节其靶基因活性,引发整个基因表达调控网络的改变,使之趋向于髓系分化过程中的基因表达变化,从而促进髓系分化进程.
关键词： miR-29a miR-142-3p 髓系分化 基因表达 GO分析 -
间充质干细胞与肝样转化细胞的基因谱差异分析
目的 用全基因表达谱芯片筛选大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)与定向分化为肝细胞样细胞(HLCs)的表达基因差异并对其进行分析研究.方法 将大鼠MSCs诱导定向分化的肝样细胞做3次生物学重复,分别取MSCs和诱导分化的肝样细胞提取总RNA进行扩增,Cy3标记.与大鼠全基因表达谱芯片杂交,荧光扫描,筛选出差异表达基因,并进行GO分析和pathway分析.用实时定量PCR对结果进行验证.结果 芯片筛选结果显示,分化后的MSCs与HLCs间的差异表达的基因多达839个,其中上调表达448个,下调表达391个.在差异基因当中有生物学过程注释的基因有363个,具有细胞组分注释的差异基因有377个,具有分子功能注释的差异基因364个.Pathway分析结果中显示在差异基因参与的273个Pathway中有显著性变化的Pathway有45个,其中参与到显著性Pathway共有275个差异表达基因,其中上调基因122个,下调基因153个.通过差异基因构建基因调控网络,按照基因在网络的度(Degree)筛选出网络当中的5个关键基因:Pkm2、Nt5e、Fos、Adcy3、Itga7.结论 MSCs体外诱导定向分化为HLCs过程中,其调节的基因与肝细胞中细胞增殖、分化、凋亡、代谢和调控等密切相关.
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急性ST段抬高型心肌梗死甲基化谱的研究
目的 应用甲基化芯片对急性ST段抬高型心肌梗死甲基化谱的研究,初步探讨急性ST段抬高型心肌梗死中甲基化谱的调控网络.方法 选择2009年12月至2011年6月间本院在急诊科首诊并确诊为STEMI的男性患者10人,及同期本院健康体检年龄匹配的男性10人作为对照组,采用甲基化DNA免疫沉淀,分别与两张NimbleGen CpG启动子芯片进行杂交,对杂交信号标准化和比对分析.利用SigMap和DAVID生物信息学工具对筛选基因进行染色体定位、功能分类和通路分析.结果 STEMI组与对照组对比的DMRs的数量为1 634个,其中分布于HCP的量为1480个(90.57％)、ICP的量为131个(8.02％)和LCP的量为23个(1.41％);GO分析和Pathway分析显示STEMI组发生甲基化变化有显著性差异基因分布的信号通路有甘油磷酯代谢、半胱氨酸和甲硫氨酸代谢、扩张型心肌病、致心律失常右室心肌病、肌动蛋白细胞骨架调节、钙离子信号通路等,而与脂质代谢相关的信号通路其甲基化变化无显著差异.结论 运用甲基化芯片和生物信息学工具可快速、高通量地分析甲基化芯片数据,并实现对STEMI甲基化基因初步功能分类.
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高低剂量X射线照射正常人淋巴母细胞基因表达转录谱的研究
目的 比较高低剂量X射线照射对基因表达影响的差异性,探讨不同剂量辐射生物效应的作用机制.方法 采用包含有45 033个基因的NimbleGen 12×135K芯片分析0.1和5 Gy照射正常人淋巴母细胞AHH-1培养6h后基因表达谱的改变,以差异为2倍以上且两组实验结果一致的标准确定为有效差异表达基因.用real-time PCR和Western blot方法验证了共同表达基因PERP的表达.结果 0.1 Gy照射后,有760个基因表达上调,1222个基因表达下调；5 Gy照射后,上调和下调基因分别是457和744个.在两个剂量照射条件下共同表达上调的基因有55个,同时下调的基因有339个.低剂量组差异表达基因主要参与细胞信号转导、DNA损伤反应等过程,高剂量组主要参与凋亡、细胞增殖分化等过程.real-time PCR和Western blot方法验证了PERP的表达与芯片结果相一致,均表达下调.结论 高低剂量照射后基因表达改变存在质和量的差异,可更好地阐释高低剂量电离辐射生物学效应的作用机制.
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实验性蛛网膜下腔出血后脑动脉的基因表达谱及功能分析
目的 探讨兔蛛网膜下腔出血(SAH)后脑血管痉挛(CVS)基底动脉和正常基底动脉基因表达的差异.方法 兔SAH模型脑基底动脉及正常兔脑基底动脉的cDNA基因芯片下载于GEO数据库.使用Bioconductor软件对芯片进行分析筛选,并用Cytoscape软件对差异表达基因进行功能富集和信号通路分析.随后选取成年雄性日本大耳兔6只,随机分为正常对照组(n=3)和SAH模型组(n=3).采用枕大池二次注血法复制兔SAH模型,取第0天未行手术处理的对照兔基底动脉标本RNA和第5天SAH后基底动脉标本RNA行qRT-PCR,验证部分差异基因.结果 在兔正常基底动脉和兔SAH模型基底动脉中共获得4356个差异表达的基因,其中920个差异表达基因(P<0.05),如GRIK1、MYH13、ZNF45、SAA3、RLN1、MSR1等.功能富集分析结果显示差异表达基因涉及钙离子跨膜转运蛋白活性调节、离子跨膜转运负调控、钾离子转运调控、JAK-STAT信号通路级联的正调节等相关生物学过程.通路分析显示这些基因与钙信号通路、cGMP-PKG信号通路、HIF-1信号通路、PI3K-Akt信号通路等有关.qRT-PCR验证表明SAH模型组MSR1下调,与芯片结果一致.结论 兔造模后CVS基底动脉中存在基因的差异化表达,并且MSR1基因可以作为研究CVS病理机制的潜在靶点.
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中性内肽酶相互作用蛋白质的功能
目的 分析与中性内肽酶(NEP)相互作用的蛋白质的功能.方法 利用在线蛋白质间相互作用的数据库PINA2获得与NEP相互作用的蛋白质,并利用基因本体(GO)和KEGG分析这些蛋白质的功能.结果 PINA2数据库显示与NEP相互作用的蛋白质有176个;GO分析显示这些蛋白质分布于细胞内的各个区域,一部分可以分泌出细胞发挥作用,可以与蛋白、核酸及酶类结合,参与细胞内蛋白质定位、多肽和RNA降解、大分子代谢及血管紧张素成熟.KEGG信号通路结果显示NEP相结合蛋白参与帕金森病、阿尔茨海默病等疾病过程,还参与蛋白降解及吞噬过程.结论 NEP及其相互作用蛋白可以通过调节蛋白定位和大分子降解参与帕金森病及阿尔茨海默病的疾病过程,并且一部分可以分泌到细胞外,为帕金森病和阿尔茨海默病的诊断和治疗提供潜在靶点.
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抗癌新药NSC319726对卵巢癌基因表达影响的研究
目的：研究抗癌新药NSC319726对卵巢癌基因表达的影响。方法下载GEO数据库，研究NSC319726对卵巢癌细胞系TOV112 D影响的数据，进行生物信息学分析。结果 NSC319726上调卵巢癌细胞246个基因、下调198个基因；上调基因包括MMP3与CXCR4等，下调基因包括PBX1等。 GO分析中，我们发现6个GO条目与物质代谢有关。 Pathway分析发现，NSC319726可以影响生物钟及MMP信号通路相关基因。结论抗癌新药NSC319726可影响卵巢癌细胞系中多个功能基因的表达，因此它可能是前体B细胞急性淋巴细胞白血病潜在的治疗药物。但需要注意的是， NSC319726也可能对肿瘤转移、人体睡眠产生不利影响，故临床运用前有待更多研究。
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肠炎和肠炎相关结直肠癌miRNA表达检测及生物信息学分析
背景与目的：炎症性肠病(inflammatory bowel diseases，IBD)为一组慢性肠道疾病，包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)与克罗恩病(Crohn’s disease，CD)。肠炎相关性结直肠癌(colitis-associated col-orectal cancers，CAC)是由IBD癌化形成的一种恶性肿瘤。该研究通过检测UC、CD和CAC组织中相关微小核糖核酸(miRNA)的水平，初步探讨其作为肠炎癌转化分子标志物的可能性，并对在肠炎和CAC中显著变化的一组miRNAs进行靶基因归集和生物信息学分析，为以miRNAs为靶点的基因治疗提供理论和实验基础。方法：采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time lfuorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR)技术，检测13例UC组织、3例CD患者组织、12例CAC组织及8例正常肠组织中16种miRNAs的表达。通过生物信息学对显著变化的一组miRNA进行靶基因分析，将文献中已报导的所有靶基因进行汇总，并利用DAVID数据库对靶基因进行功能富集分析(GO-analysis)和信号转导通路富集分析(KEGG-analysis，BIOCARTA-analysis)。结果：炎症相关miR-146a和癌症相关miR-27a、miR-29a、miR-20a、miR-21在UC、CD和CAC中的表达都显著高于正常结肠组织，且这一组miRNA的靶基因都富集在癌症相关通路、免疫信号相关通路和炎癌转换相关通路上。结论：miR-146a、miR-27a、miR-29a、miR-20a和miR-21可能是参与肠炎向结直肠癌转化的一组miRNA。
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子宫内膜异位症全基因组甲基化的研究
目的 子宫内膜异位症(endometriosis,EM)是妇科的多发病和常见病,发病率逐年增加.但内异症的发病机制至今并不明确.EM类似恶性肿瘤的生物学行为可能是EM重要的发病机制之一,而恶性病变的发生、发展是以抑癌基因和癌基因遗传变异的积累为标志的,尤其是抑癌基因的异常甲基化.方法 抑癌基因非甲基化的CpG岛异常甲基化与人类恶性肿瘤的发生、转移密切相关.本实验采用成组病例对照方法,选取以手术病理确诊为卵巢型EM的汉族妇女6例为研究对象,选取患者的在位内膜组织标本和异位内膜组织标本各6例,选择同期住院患者中族别、年龄、文化程度等构成比相似的非EM的汉族妇女6例为对照组,选取患者的正常在位内膜组织标本6例.采用美国illumina公司生产的illumina Human Methylation450K Beadchip全基因组甲基化芯片进行全基因组甲基化研究,通过对全基因组甲基化芯片的总共48万个甲基化位点进行综合生物信息学分析.结果 通过对EM患者原位和异位内膜组织样品的全基因DNA甲基化修饰进行检测,并进行聚类分析、主成分分析、GO功能注释和KEGG信号通路分析,发现在EM患者的全基因甲基化修饰水平发生了显著变化.对差异甲基化的基因进行GO功能注释,结果发现富集的GO条目主要集中于免疫过程的抗原呈递和干扰素Y的相关通路,分子功能主要集中在协同转运、负离子跨膜转运等活性,而KEGG通路分析发现,1型糖尿病,自身免疫性甲状腺疾病相关信号通路被显著富集.其中,富集程度高的通路是focal adhesion通路,参与其中的蛋白分子包括ECM-受体互作,细胞因子-受体互作,这些结果为揭示新的EM的发病分子机制提供了参考.结论 该实验为EM病因学研究提供新的理论依据,从而为EM分子生物学发病机制的研究提供新思路.
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肾透明细胞癌相关特异miRNAs的筛选及分子网络调控机制分析
目的 miRNAs(microRNAs)是肿瘤重要的调节因子,对细胞增殖、细胞周期的控制、逃避细胞凋亡、组织侵袭及转移、血管形成、无限复制潜力均起到重要的调节作用.文中对肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)与癌旁正常肾组织的差异miRNAs表达谱进行分子网络调控机制分析,找到关键miRNA并验证其靶基因.方法 通过TargetScan预测得到差异miRNA调控的所有靶基因,并在筛选后利用GO显著性功能分析和KEGG Pathway显著性分析,构建差异miRNA与靶基因的调控网络.筛选关键miRNA及其靶基因,对miR-199a-5p调控的靶基因进行验证.结果 miR-22、miR-199a-5p、miR-429是调控网络的关键miRNA.转化生长因子β受体1(transforming growth factor-β receptor 1,TGFBR1)、jun B原癌基因(jun B proto-cologene,JunB)是miR-199a-5p的靶基因.结论 miR-199a-5p通过抑制TGFBR1、JunB的表达在ccRCC进展过程中起到重要的调控作用.
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大鼠骨髓间充质干细胞分化成肝细胞过程中差异基因的功能研究
目的 探寻大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)分化成肝细胞过程中的核心调控机制.方法 利用芯片检测结果,筛选大鼠骨髓MSCs诱导分化成肝细胞样细胞(hepatocytelike cells,HLCs)、正常肝细胞(normal liver cells,NLCs)动态发展过程中差异表达的基因,利用基因的表达变化进行表达趋势聚类,筛选出显著性的表达趋势.集中分析具有相同趋势的共表达基因,构建基因的共表达调控网络,从中筛选在动态变化过程中的核心基因.结果 从MSCs分化成NLCs的动态过程中,通过筛选得到4 938个差异表达基因,Fas、G6pc、IL1b、S100a1、Ndufa7等基因为关键基因.结论 MSCs终分化成NLCs的过程中,与细胞周期调控、增殖、分化相关基因及糖、脂肪酸、胆固醇的代谢、解毒相关基因表达密切相关.
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胚胎干细胞分化为表皮样细胞的基因表达谱差异
[目的]用全基因表达谱芯片技术筛选小鼠胚胎干细胞(ESC)定向分化为表皮样细胞(ELC)的差异表达的基因并对其进行分析,以进一步阐明ESC分化为ELC的分子机制.[方法]利用人羊膜建立体外诱导体系,将小鼠ESC诱导定向分化为ELC,做3次生物学重复,分别取未分化的ESC和诱导分化的ELC提取总RNA进行扩增、Cy3标记,与NimbleGen 135k小鼠全基因表达谱芯片(含44170个基因)杂交,荧光扫描,筛选出差异表达基因,并进行GO分析和pathway分析,用实时定量PCR对结果进行验证.[结果]芯片筛选结果显示,分化后的ELC与ESC间的差异表达的基因多达4856个(Cut off:2).基因本体(GO)分析显示与生物学过程相关的差异表达基因多的是细胞过程,1931个；与亚细胞组分(CC)相关的差基因中多的是细胞和细胞组分相关基因,2391个；与分子功能相关的差异基因中多是的结合功能(binding)基因,1869个.Pathway分析显示,与DNA复制通路相关的差异基因有23个；与蛋白酶体通路相关的24个；剪接体通路相关有47个;细胞周期相关的有44个.[结论]ESC体外诱导定向分化为ELC过程中,基因表达谱发生了巨大的变化,提示细胞分化是一个众多基因参与的复杂的生物学过程,这些基因在分化过程所起的作用和作用机制尚需大量的实验研究阐明.
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应用定量蛋白质组学技术对IgA肾病肾组织蛋白的鉴定和定量分析
目的 应用相对和绝对定量的同位素标记(iTRAQ)结合液相色谱和质谱技术,对IgA肾病肾组织蛋白质进行鉴定和定量分析.方法 利用iTRAQ技术分析IgA肾病肾组织及正常对照肾组织中的蛋白质组信息,寻找显著差异表达蛋白质.结果 共鉴定1860个蛋白,其中287个蛋白在Ig A肾病肾组织中显著上调表达,287个蛋白显著下调表达,终筛选出9个明显上调蛋白和8个明显下调蛋白.结论 定量蛋白质组学技术可有效地用于组织蛋白鉴定和相对定量,利于更好地了解蛋白质与Ig A肾病发病机制的关系.
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兴义维蚋幼虫气管鳃特异表达候选基因筛选
目的:筛选兴义维蚋幼虫气管鳃发育早期特异表达的基因.方法:将发育成熟的1～7龄期的蚋幼虫气管鳃蛋白作为抗原免疫新西兰家兔,制备兴义维蚋气管鳃蛋白多克隆抗血清,用Western blot法分析气管鳃特异表达蛋白;以LC-MS/MS对气管鳃特异蛋白进行质谱分析,采用GO分析及手工检索FlyBase数据库分析蛋白组成.结果:发现63 kDa处存在整个幼虫期均表达的蛋白,对63～75 kDa蛋白进行质谱分析,发现具有几丁质结合特性的蛋白质Gasp和Cda4.结论:初步确定Gasp和Cda4基因可作为气管鳃早期发育特异表达候选基因.
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miRNA let-7f-1-3p在伯基特淋巴瘤中的差异性分析
目的 研究伯基特淋巴瘤(BL)中差异表达的miRNA,探讨可用于BL鉴别诊断的miRNA标志物.方法 收集BL病例,miRNA芯片筛选其与淋巴结反应性增生之间的差异miRNA表达谱;运用miRWalk数据库对差异miRNA进行靶基因预测;利用MAS3对靶基因进行GO注释和KEGG信号通路分析.结果 与淋巴结反应性增生组织相比,BL中共有46个表达异常的miRNA,包括3 1个上调miRNA和15个下调miRNA;对miRNA let-7f-1-3p靶基因预测得到2837条靶基因,与BL密切相关的基因有16个:CENPC1、FANCF、IL4R等;GO注释显示主要涉及多细胞器官发育,RNA聚合酶Ⅱ启动子转录调控等生物学过程,KEGG分析显示主要涉及癌症信号通路,TGF-beta信号通路中.结论 在BL中发现了表达异常的miRNA,生物信息学分析对差异miRNA分析结果提示,这些差异miRNA可以作为BL鉴别诊断的新肿瘤标志物.
