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人参总皂苷对体外培养肌管形态及Atrogin-1表达的影响
目的:慢性肾衰竭(CKD)尤其进入终末期透析的患者常并发以骨骼肌蛋白质-能量消耗为特征的营养不良,研究表明Atrogin-1激活是肌肉蛋白分解的关键步骤.本实验通过培养肌细胞,观察人参总皂苷的干预下,对糖皮质激素作用下肌细胞形态改变及Atrogin-1的表达的影响.方法:培养小鼠肌原细胞C2C12并使之融合成肌管,以不同浓度的地塞米松(0~10μm)和人参总皂苷(100 μmol/L)刺激肌管后,镜下观察肌管形态改变,Western blot检测Atrogin-1蛋白表达水平.结果:糖皮质激素地塞米松作用下,可剂量依赖性地使肌管变细,肌管Atrogin-1蛋白表达水平显著增高;在人参总皂苷干预后,肌管形态较地塞米松组增粗,同时肌管Atrogin-1蛋白降低(P<0.05).结论:人参总皂苷能够改善地塞米松作用下肌肉消耗,并下调肌管Atrogin-1蛋白表达水平.
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小鼠Atrogin-1基因真核表达载体的构建及其在293T细胞中的表达
目的:构建小鼠Atrogin-1基因真核表达载体,研究其功能,并探讨其在癌性恶液质骨骼肌萎缩中的作用机制.方法:提取小鼠C2C12细胞RNA,反转成cDNA,PCR合成含有酶切位点的Atrogin-1 cDNA全长,酶切后连接到真核表达载体pcDNA3.1, 构建重组真核表达载体pcDNA3.1-Atrogin-1, 经鉴定及测序证实cDNA片段大小和序列正确,然后用其转染293T细胞,Western blot法检测Atrogin-1蛋白的表达.结果:pcDNA 3.1-Atrogin-1含大小、序列正确的Atrogin-1cDNA片段,转染pcDNA3.1-Atrogin-1的293T细胞裂解液中能检测到Atrogin-1蛋白高表达.结论:成功构建了Atrogin-1基因真核表达载体pcDNA 3.1-Atrogin-1,并在真核细胞中表达了目的蛋白,其是研究癌性恶液质的重要工具.
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小檗碱对糖尿病db/db小鼠骨骼肌蛋白质代谢的影响及机制研究
目的 探讨小檗碱对糖尿病/胰岛素抵抗模型db/db小鼠骨骼肌蛋白质代谢及肌萎缩蛋白Fbox-1(Atrogin-1)表达的影响.方法 db/db小鼠为研究对象,以野生型为对照组.予小檗碱(5 mg·kg-1·d-1)腹腔注射3周,观察体重和食量;3周末处死,分离胫骨前肌和腓肠肌.胫骨前肌冰冻切片行层黏连蛋白免疫组化染色,荧光显微镜下观察并拍照,测量肌纤维横截面积并计算肌纤维面积分布图;同位素[14C]-苯丙氨酸掺入法检测肌肉蛋白合成,[3H]-酪氨酸释放率分析检测肌肉分解代谢;Northern印迹检测腓肠肌Atrogin-1和肌环指蛋白1(MurF-1)转录水平,Western印迹检测蛋白翻译水平.结果 小檗碱能明显降低db/db小鼠血糖水平[(18.55---3.79对26.32±4.02)mmol/L,P＜0.01],降低脂肪重量[(2.75±0.30对3.77±0.52)g,P＜0.05],使胫骨前肌的肌重/胫骨长度比值及肌纤维横截面积下降,肌纤维面积分布图明显左移;小檗碱使野生型j、鼠和db/db小鼠的蛋白质合成率下降18％ ～ 22％;蛋白质分解率升高24％～ 26％,使肌肉特异性的Atrogin-1、MurF-1转录和翻译水平增高,同时使真核转录因子3调节亚基(eIF3-f)蛋白水平降低.结论 小檗碱具有降糖降脂作用,但可引起骨骼肌蛋白质合成下降,促进蛋白质分解代谢,加剧糖尿病的骨骼肌消耗,其机制与上调Atrogin-1和MurF-1表达,同时下调elF3-f有关.
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Atrogin-1基因在贲门腺癌组织中的表达及其异常甲基化
目的:探讨atrogin-1基因在贲门腺癌(gastric cardia adenocarcinoma,GCA)中的异常甲基化及表达,并分析其临床意义.方法:选用河北医科大学第四医院2004-2008年间的贲门腺癌患者手术标本共139例,分别应用亚硫酸氢盐转换-甲基化特异性PCR(bisulfite conversion-methylation specific polymerase chain reaction,BS-MSP)、RT-PCR和免疫组织化学法检测贲门腺癌组织及相应癌旁(距癌灶边缘3 ～5cm)组织中atrogin-1基因的甲基化、mRNA和蛋白表达情况,应用免疫组织化学法检测相应组织中Smad4蛋白的表达.结果:贲门腺癌组织中atrogin-1基因启动子区的甲基化率[44.6％ (62/139)]显著高于癌旁组织[3.6％ (5/139)](x2=63.891,P=0.001),且atrogin-1基因的甲基化与TNM分期及肿瘤的组织学分化程度密切相关(x2=6.144,P＜0.05).贲门腺癌组织中atrogin-1基因的mRNA和蛋白表达水平显著低于癌旁组织[(0.482 5± 0.175 4)vs (0.8969 ±0.290 l),t=10.62,P=0.01;34.5％ vs 82.0％,x2=4.441,P=0.001],且与其启动子区的甲基化状态之间有明显的相关性(r=-0.256,P=0.001).贲门腺癌组织中Smad4蛋白表达的阳性率显著低于癌旁组织(46.0％ vs95.7％;x2=2.945,P=0.001),且与atrogin-1蛋白表达之间呈明显的正相关(r=0.604,P=0.001).结论:Atrogin-1基因启动子区高甲基化导致的基因沉默可能是贲门癌组织中此基因表达降低的机制之一.
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保元解毒汤改善癌性恶病质模型小鼠骨骼肌萎缩的实验研究
目的:复制癌性恶病质模型,探讨保元解毒汤对癌性恶病质模型骨骼肌萎缩的影响.方法:用Lewis肺癌细胞株皮下接种C57BL/6小鼠,复制肺癌恶病质小鼠模型.40只小鼠随机分为四组:正常对照组、模型对照组、中药干预组和醋酸甲羟孕酮组.HE染色后测量小鼠肌纤维横径,免疫组化法测定小鼠腓肠肌中Atrogin-1、MuRF-1的蛋白表达水平.结果:①形态学观察结果与实验数据结果一致.②与正常对照组比较,模型对照组腓肠肌肌纤维横径明显减小(P＜0.01);与模型对照组和醋酸甲羟孕酮组比较,中药干预组腓肠肌肌纤维横径明显增加(P＜0.01);③与正常对照组比较,模型对照组Atrogin-1、MuRF-1的蛋白表达水平明显增强(P＜0.01);与模型对照组和醋酸甲羟孕酮组比较,中药干预组肌肉中Atrogin-1、MuRF-1的蛋白表达水平明显降低(P＜0.01).结论:保元解毒汤可增加恶病质模型肌纤维横径,降低肌肉中Atrogin-1、MuRF-1的蛋白表达,改善恶病质骨骼肌萎缩.
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肺癌组织中Atrogin-1基因mRNA表达及其临床意义
目的 研究肺癌组织中Atrogin-1基因mRNA表达及其与临床病理参数的关系.方法 用PCR技术和免疫组化技术检测60例肺癌患者癌组织和癌旁正常肺组织的Atrogin-1基因mRNA及其蛋白表达.结果 肺癌组织中Atrogin-1基因mRNA表达及Atrogin-1蛋白表达观显高于癌旁正常肺组织(P均<0.01).临床病理参数分析显示,Atrogin-1基因mRNA表达与结核病史、淋巴结转移、肿瘤体积、肿瘤分期、体质量下降和血清白蛋白有关(P均<0.05);Atrogin-1蛋白表达与淋巴结转移、家族史、肿瘤体积、肿瘤分期、体质量下降和血清白蛋白有关(P均<0.05).结论 Atrogin-1基因在肺癌发生发展中起重要作用,其对监测患者病情进展、转移潜能及估计预后有临床价值.
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肺癌组织中Atrogin-1 mRNA的表达及患者生存分析
目的:检测人肺癌组织中Atrogin-1基因mRNA表达水平,了解对肺癌患者术后生存情况及其影响因素.方法:运用实时定量PCR技术测定60例肺癌患者的癌组织及配对的癌旁组织中Atrogin-1基因mRNA表达水平,采用Kaplan-Meier单因素与Cox多元回归进行生存分析.结果:肺癌组织中Atrogin-1 mRNA表达水平(-8.15±3.94)显著高于其配对的癌旁组织(-10.39±4.35)(t=3.873,P =0.000),其中71.67%(43/60)患者Atrogin-1 mRNA高表达,28.33%(17/60)患者低表达.Kaplan-Meier法生存分析结果显示:Atrogin-1的表达水平、淋巴结转移、家族史、病理分级与患者的生存率显著相关.Cox回归分析结果显示:Atrogin-1 mRNA表达水平、淋巴结转移、病理分级和吸烟是影响肺癌患者生存率的独立危险因素.结论:肺癌组织中Atrogin-1 的高表达可能影响肺癌患者术后的生存,其可作为肺癌患者预后的一个评价指标,并可能成为基因治疗的一个作用靶点.＃
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肌肉细胞特异性泛素蛋白连接酶在癌性恶液质小鼠骨骼肌中的表达
)g、(108.80±14.82)mg比(125.00±10.00)mg(P＜0.05).荷瘤组腓肠肌中Atrogin-1和MuRF1在mRNA水平表达分别达对照组的24.83和2.9.02倍,其蛋白水平表达也升高.结论 E3表达上调在癌性恶液质肌萎缩发生机制中起重要作用.
