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POLH基因实时荧光定量PCR检测条件的建立
研究表明,环境化学污染物可以引起各种类型的DNA损伤,而POLH基因与DNA损伤所引起的细胞内反应即DNA的跨损伤合成(translesion synthesis,TLS)有关.因此,有必要寻找出一种敏感度极高的方法来检测POLH基因在mRNA水平上的表达变化,从而为探讨POLH基因在环境化学污染物所诱导的跨损伤DNA合成中的分子作用机制提供相应的线索.
关键词： SYBR Green Ⅰ 实时荧光定量PCR POLH -
大肠杆菌ftsK基因的相对表达定量PCR方法的建立
利用嵌合荧光标记,建市了用于ftsK基因表达水平解析的两步法实时定量PCR.利用该方法对ftsK基因在感染鸡体内的表达水平进行了解析.结果 表明,相对于体外培养,APEC E058株ftsK在鸡体内的表达上调了23.57倍.
关键词： SYBR Green Ⅰ 定量PCR ftsk -
太子参药材的快速分子鉴定
为建立一种简便快捷的太子参分子鉴定方法,对太子参药材及其混伪品的rDNA-ITS片段进行比对分析,找出特异性片段,设计太子参鉴别引物,并优选扩增条件,扩增产物经100×SYBR Green Ⅰ染色后紫外光下观察.结果显示,PCR扩增反应液(包括DNA Taq聚合酶预混液5.5 μL,Tzs-2F,Tzs-2R各10 pmol,DNA模板20～ 80 ng,双重灭菌蒸馏水加至25μL)经95℃预变性1 min,95℃变性5 s,56℃退火延伸15 s,30个循环,72℃后延伸30 s后,在扩增产物中加入1μL100×SYBR Green Ⅰ混匀后于紫外光下呈绿色荧光的为太子参,混伪品无绿色荧光出现.40 min内即可完成DNA提取、扩增等整个鉴定过程.该方法能特异性扩增太子参DNA,紫外光下肉眼观察即可鉴定药材的真伪,且操作简捷、结果准确、利于推广,可为快速鉴定中药材的真伪提供参考.
关键词： 太子参 分子鉴定 特异性PCR SYBR Green Ⅰ -
SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测埃博拉病毒方法的建立
为了建立一种快速准确的检测埃博拉病毒(EBOV)亚型的方法.本研究根据GenBank中公布的EBOV NP基因序列,通过设计引物和优化反应条件,建立了一种SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法检测EBOV.以体外转录的EBOV RNA为模板进行试验,该方法检测的灵敏度可以达到1.0×102个拷贝/μL,检测范围达到9个数量级为102～1010,可检测5种亚型EBOV.建立的方法对马尔堡病毒(MARV)、登革病毒(DENV)、新疆出血热病毒(XHFV)、乙型脑炎病毒(JEV)、流感病毒(H1N1和H3N2)和猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)E基因组RNA无非特异性扩增.本文将荧光定量RT-PCR技术用于埃博拉病毒的定量检测中,并且建立了EBOV SYBRGreen Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法.
关键词： 埃博拉病毒 荧光定量 RT-PCR SYBR Green Ⅰ 检测 -
吡格列酮对大鼠骨骼肌细胞脂联素受体基因表达的影响
为研究吡格列酮对大鼠骨骼肌细胞脂联素受体表达的影响,应用体外原代培养骨骼肌细胞和SYBR Green Ⅰ实时定量PCR,观察不同浓度吡格列酮对鼠骨骼肌细胞脂联素受体表达水平的影响.结果表明,不同浓度的吡格列酮作用于大鼠骨骼肌细胞20h后对脂联素的受体R1表达没有显示出任何有意义的变化.大鼠骨骼肌细胞脂联素受体基因表达可能与胰岛素增敏剂噻唑烷二酮类吡格列酮无关.
关键词： 脂联素受体 脂联素 噻唑烷二酮类 SYBR Green Ⅰ -
SYBR GreenⅠ实时PCR检测乙脑病毒方法的建立与初步应用
目的 建立一种快速、特异的SYBR Green Ⅰ实时PCR方法检测流行性乙型脑炎(乙脑)病毒.方法 对SYBR Green Ⅰ实时PCR检测乙脑病毒方法的反应条件、反应体系进行优化,同时与传统RT-PCR方法进行灵敏度比较,提高该方法的特异性、灵敏性.并用该方法对乙脑病毒毒株、登革病毒(Ⅰ～Ⅳ型)毒株、90份猪血清标本进行检测.结果 SYBR Green Ⅰ实时PCR与传统RT-PCR检测乙脑病毒方法的灵敏度无明显区别,但检测时间缩短了1/2.该方法可检测出乙脑病毒,不能扩增登革病毒,对90份猪血清标本检测结果均为阴性.结论 建立的SYBR Green Ⅰ实时PCR方法用于乙脑病毒检测具有特异、灵敏、快速等优点,可用于乙脑的病原学监测.
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实时定量RT-PCR监测造血干细胞移植前后CML28 mRNA表达
本研究的目的在于建立检测CML28 mRNA的SYBR Green Ⅰ实时定量PCR(RQ-PCR)的方法,并探讨CML28表达水平与异基因造血干细胞移植(Allo-HSCT)后白血病复发之间的相关性,为此构建了pcDNA3.1 HisA-CML28质粒作为定量模板,选择14例白血病患者进行研究.14例患者包括:10例慢性髓系白血病(CML),3例急性髓系白血病(AML),1例Ph阳性急性淋巴细胞白血病(Ph+ALL).应用Roche Light Cycler PCR仪动态监测患者移植前后不同时间段的50份骨髓单个核细胞中CML28表达水平.研究结果表明:RQ-PCR的灵敏度为10-4(0.05 ng)水平,标准品日间差及日内差均小于10%,重复性好.初治组中AML和CML加速期(CML-AP)与急变期(CML-BC)患者CML28呈高表达(6.58±2.34)×10-2,预处理前组CML28水平为(2.19±0.32)×10-2,移植后1月组CML28水平为(1.35±1.28)×10-2,移植后3月及以后组(以下简称移植后3月组)CML28水平为(4.57±6.39)×10-3.定期随访表明,3例CML-AP或BC患者与1例CML慢性期(CML-CP)患者,在Allo-HSCT 3个月后检测仍呈阳性,其中2例CML28 mRNA的水平＜2×10-2,获无病生存;2例CML28水平＞2×10-2者,一年内均出现复发,其中1例死亡,另1例行第2次Allo-HSCT后CML28水平虽然迅速下降,但仍＞2×10-2,2个月后再次复发.结论:CML28水平与疾病的演变过程存在良好的相关性,对于造血干细胞移植受者,动态监测CML28水平比单一的结果价值更大,实时定量检测移植后CML28水平对预测白血病复发有一定的意义.
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IgH重排的实时定量PCR检测及反应参数研究
为了探讨以通用引物应用PCR技术扩增克隆性免疫球蛋白重链基因(IgH)重排的佳实验条件及SYBRGreen Ⅰ实时定量PCR检测该基因的可行性,以通用引物对克隆性IgH重排进行扩增,对影响PCR扩增的退火温度、引物浓度、Taq酶用量、dNTP浓度、镁离子浓度、循环次数等实验因素进行了系统研究,找出佳反应参数,并以通用引物进行了SYBR green Ⅰ实时定量PCR对IgH重排基因的检测,测定了该法检测IgH重排基因的敏感性.结果表明:佳退火温度为60℃,佳引物浓度为0.8 μmol/L,0.5 U的Taq酶量效果满意,适dNTP浓度为100μmol/L,适镁离子浓度为3.0 mmoL/L,佳循环次数为40次.SYBR Green Ⅰ实时定量PCR可以实现对克隆性IgH重排的扩增和荧光信号的检测分析,其对IgH重排基因检测的敏感性为10 4/ml.结论:确定了应用PCR技术检测克隆性IgH重排的适反应条件,实现了用通用引物对克隆性IgH重排稳定、特异的扩增,初步实现了以通用引物和应用SYBR Green Ⅰ实时定量PCR对IgH重排的检测.
关键词： PCR IgH重排 SYBR Green Ⅰ 实时定量PCR -
基于特异性聚合酶链式反应的西红花快速分子鉴别研究
目的 建立一种基于特异性聚合酶链式反应(PCR)及荧光染料检测快速鉴别西红花真伪品的方法.方法 通过对叶绿体基因片段测序和比对分析,找出西红花与其常见掺伪品序列差异,针对差异碱基设计特异性引物,构建并优化聚合酶链式反应扩增反应体系,使用荧光染料法检测聚合酶链式反应产物,实现西红花的快速鉴别.结果 建立了基于psb A-trnH序列的西红花鉴别体系,优化后的聚合酶链式反应反应条件为90℃预变性l min,90℃变性5 s,58℃延伸5 s,26个循环.在聚合酶链式反应反应产物中加入染料SYBR Green Ⅰ,西红花正品出现强烈绿色荧光,而伪品无荧光.结论 位点特异性聚合酶链式反应方法可以简单快速鉴别西红花及其掺伪品.
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SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR法测定猴免疫缺陷病毒(SIV)前病毒DNA拷贝数方法的建立
目的 建立SYBR Green Ⅰ荧光染料实时定量PCR方法,测定猴免疫缺陷病毒(SIV)前病毒DNA.方法 巢式RT-PCR扩增SIVmac251病毒RNA gag基因上1360-1837之间的长度为477 bp的片段,将该片段克隆到pGEM T载体上,构建pGEM-SIVgag477质粒.该质粒经大量扩增纯化后定量,10倍系列稀释后,做出标准曲线,作为SIV前病毒DNA荧光定量检测的外标准品.结果 应用Roche公司FastStart DNA Master SYBR Green Ⅰ Kit,该标准品可精确定量到10 copies/μL.结论 制备的pGEM-SIVgag477质粒外标准品纯度高,SYBR Green Ⅰ荧光染料实时定量PCR法特异性、敏感性高,稳定性好,可用于定量测定猴免疫缺陷病毒(SIV)前病毒DNA载量.
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实时荧光定量PCR法检测结肠癌患者P53基因表达水平的研究
目的 探讨P53基因在结肠癌组织中的表达水平,研究其与结肠癌发生、发展的关系.方法 建立实时荧光定量PCR方法,检测各组织中P53基因的表达情况.结果 扩增曲线呈典型的"S"型曲线;熔解曲线分析扩增产物显示单一的峰,熔解温度(Tm)为60℃.对照组中P53基因的表达明显高于癌组和癌旁组(P＜0.05);癌组中P53基因的表达明显低于癌旁组(P＜0.05).结论 实时荧光定量PCR方法具有高敏感性和高特异性等优点,可作为进一步研究P53基因的方法;p53基因的表达量可以作为判断结肠癌患者预后的重要指标.
关键词： 结肠癌 p53基因 SYBR Green Ⅰ 实时荧光定量PCR -
人参β-actin基因实时荧光定量PCR方法的建立
目的 建立人参β-actin基因实时荧光定量PCR的方法.方法 根据GenBank上其他高等植物β-actin基因保守区域设计一对特异性引物,将从人参中PCR扩增得到的β-actin基因克隆到pMD20-T载体上构建重组质粒,经1/10梯度稀释后用于制定标准曲线,并进行反应的灵敏性、特异性和重复性试验. 结果 该方法检测β-actin基因的低拷贝数为43拷贝/μL,在较广的范围内(43～4.3×107拷贝/μL)有良好的线性关系(R2=0.995 3);熔解曲线分析显示扩增产物为特异性单峰,其Tm值为(84.51±0.01)℃;5个不同浓度对照品组内试验变异系数为0.58％～2.79％,组间试验变异系数为2.61％～4.41％.结论 该方法具有快速、灵敏、特异、高通量及重复性强等优点,为β-actin基因作为内参基因进行人参功能基因表达的定量分析提供了方法学基础.
关键词： 人参 内参基因 基因克隆 实时荧光定量PCR SYBR Green Ⅰ -
SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR快速检测HLA-B27方法学的建立
建立SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR法快速检测HLA-B27,拟确定该法的阳性参考区间.强直性脊柱炎患者42例、类风湿性关节炎患者53例及健康体检者80例分别应用PCR-SSP法和SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR法检测HLA-B27,并对两种方法进行比较.两种方法结果符合率为100％,初步拟定HLA-B27的阳性参考范围是:GAPDH的Ct在23.85～25.59,以99％百分位法建立HLA-B27阳性参考范围为CtB27＜21.54.SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR法快捷、灵敏,适合于临床开展.
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大鼠TGF-β1 mRNA表达水平的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR方法的建立
目的建立检测大鼠TGF-β1 mRNA表达水平的SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR方法.方法摸索SYBRGreen Ⅰ工作液的配制方法,筛选PCR反应液,优化反应中引物和MgCl2的浓度,以actin为对照,建立大鼠TGF-β1 mR-NA表达水平的SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR方法并检测大鼠肾皮质TGF-β1 mRNA表达水平.结果SYBR GreenⅠ工作液,40倍水溶液稳定性好,佳反应稀释度为1:10000.大鼠TGF-β1表达水平的SYBR Green荧光定量PCR方法,TGF-β1和actin的佳MgCl2反应浓度分别为2.5 mM和3.5 mM,引物浓度分别为0.8 μM和0.5 μM,特异扩增产物的熔解温度分别为88.1和88.6℃,因此选择在85℃时收集荧光信号.正常大鼠TGF-β1的Ct值在29.03,actin的Ct值在24.86,扩增效率分别为0.995和1.08.结论通过优化反应条件和特异性分析,成功地建立了特异、敏感的大鼠TGF-β1 mRNA SYBRGreen Ⅰ荧光定量RT-PCR.SYBRGreen Ⅰ荧光定量PCR快速、敏感、特异、经济,可以满足临床和科研的需要.
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利用SYBR Green Ⅰ实时定量PCR检测大鼠P物质mRNA方法的建立
目的:建立检测大鼠P物质(SP)mRNA的SYBR Green Ⅰ实时定量PCR方法,为检测大鼠SP基因表达提供有效的手段.方法:提取大鼠中脑总RNA,扩增SP基因片段,将其克隆入pMD-18T载体,制作标准品质粒;应用SYBR Green Ⅰ双链嵌合染料,对连续稀释的标准品质粒进行实时PCR分析,评价所建立方法的检测灵敏度;对PCR产物进行溶解曲线分析评价其特异性.结果:标准品质粒构建成功,经酶切及测序鉴定,目的片段已插入pMD-18T载体;所建立的实时定量PCR方法的低检测限度为104个拷贝/反应,在每反应104～109拷贝范围内,Ct值(荧光信号达到设定阈值所经历的循环数)与起始模板浓度具有良好的线性关系,r=0.998.结论:所建立的检测大鼠SP mRNA的SYBR Green Ⅰ实时定量PCR方法具有敏感性高、特异性强和线性范围广等特点,适用于对大鼠各种组织SP的大量样本检测.
关键词： 实时定量聚合酶链反应 SYBR Green Ⅰ P物质 -
实时定量PCR检测大鼠神经激肽1受体mRNA方法的建立及评价
目的:建立检测大鼠神经激肽1(NK1)受体mRNA的SYBR Green Ⅰ实时定量PCR方法,为检测大鼠NK1受体基因表达提供有效的手段.方法:提取大鼠中脑总RNA,扩增NK1受体基因片段,将其克隆入pMD-18T载体,制作NK1受体标准品质粒;应用SYBR Green Ⅰ双链嵌合染料,对连续稀释的标准品质粒进行实时PCR分析,评价所建立方法的检测灵敏度;对PCR产物进行溶解曲线分析评价其特异性.结果:成功构建NK1受体标准品质粒,经酶切及测序鉴定,目的片段已插入pMD-18T载体;所建立的实时定量PCR方法的低检测限度均为每反应102个拷贝,在每反应102～109拷贝范围内,荧光信号达到设定阈值所经历的循环数(Ct值)与起始模板浓度具有良好的线性关系,r=0.999.结论:所建立的检测大鼠NK1受体mRNA的SYBR Green Ⅰ实时定量PCR方法具有敏感性高、特异性强和线性范围广等特点,适用于对大鼠各种组织NK1受体的大量样本检测.
关键词： 实时定量PCR SYBR Green Ⅰ 神经激肽 大鼠 Wistar -
SYBR GreenⅠ法体外评价胆碱衍生物的抗恶性疟原虫活性
目的 观察4种胆碱衍生物对恶性疟原虫3D7株的抑制作用. 方法 用二甲基亚砜(DMSO)溶解MD(N-十二烷基-N-(2-羟乙基)-N,N-二甲基溴化铵)、ED(N-十二烷基-N-(2-羟乙基)-N,N-二乙基溴化铵)、MT(N-十四烷基-N-(2-羟乙基)-N,N-二甲基溴化铵)和ET(N-十四烷基-N-(2-羟乙基)-N,N-二乙基溴化铵)等4种胆碱衍生物,制成10倍浓度梯度(1～105 μmol/L)的溶液后,分别用RPMI 1640培养基稀释1 000倍.稀释红细胞,使疟原虫感染率为0.3％～0.5％,并用培养基将红细胞压积调至2％.测定板每孔加入20 μl含药培养液和80 μl恶性疟原虫培养物,用SYBR Green Ⅰ法测定胆碱衍生物对疟原虫增殖的抑制作用,并以青蒿素为阳性对照,计算其50％抑制浓度(IC50).结果 青蒿素、MD、ED、MT和ET对恶性疟原虫的抑制作用均随浓度的升高而增强,表现出不同程度的剂量依赖性.MD浓度＞103 nmol/L时,对恶性疟原虫的抑制率显著增加.ED和ET在高浓度(＞104 nmol/L)时抑制显著,抑制率均＞95％.MD、ED、MT和ET的IC50值分别为1 620、33.9、116和68.9 nmol/L,均高于青蒿素(5.7 nmoYL,P＜0.05).结论 4种胆碱衍生物均有一定的体外抗恶性疟原虫活性,但活性低于青蒿素.4种衍生物中,ED对恶性疟原虫3D7株的抑制作用强.
关键词： 胆碱衍生物 恶性疟原虫3D7株 SYBR Green Ⅰ 青蒿素 -
SYBR GreenⅠ实时荧光定量逆转录聚合酶链反应检测前列腺癌抗原3mRNA表达水平
目的采用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,建立检测前列腺癌抗原3(DD3)mRNA的标准,定量检测人体不同组织中该基因的表达水平.方法从LNCaP细胞中采用RT-PCR法扩增特异性DD3基因片段,将其与pMD 18-T载体连接,转化宿主菌JM109,对质粒标准进行聚合酶链反应(PCR)检测及测序.纯化后检测质粒拷贝浓度,制备梯度浓度标准品.应用LightCycler荧光定量PCR仪对标准品进行检测.取正常人乳腺组织、膀胱、结肠、尿道、肺、睾丸、精囊、卵巢、正常前列腺组织、前列腺增生及前列腺癌组织,定量检测DD3 mRNA表达.结果建立稳定的检测DD3 mRNA的标准,正常人乳腺、膀胱、结肠、尿道、肺、睾丸、精囊、卵巢中无DD3 mRNA表达,在正常前列腺及前列腺增生组织中低表达,两者间差异无显著性(P＞0.05);在前列腺癌中高表达(P＜0.05).结论应用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR技术检测DD3 mRNA表达水平简便、可行、经济.DD3基因的表达具有良好的前列腺癌特异性.
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SYBR green Ⅰ结合熔解曲线分析快速检测GSTM1基因多态性
目的建立一种快速检测人类谷胱甘肽S转移酶(GST)基因多态性的方法并初步应用.方法反应体系中加入新型荧光染料SYBR green Ⅰ,应用多重PCR同时扩增GSTM1基因及内参照CYP1A1基因.PCR反应结束后,以0.1℃/s的速度从65℃到95℃检测并记录反应管荧光的变化,根据得到的熔解曲线分析GSTM1基因型.结果GSTM1基因携带型(GSTM1+)熔解曲线出现两个峰带,GSTM1基因空白型(GSTM1-)只出现一个峰带,两峰峰尖所对应的温度值与预期值相同,琼脂糖凝胶电泳显示PCR产物分子量与预期分子量一致.DNA抽提后整个检测在LightCycler扩增仪上1 h内完成.结论SYBR green Ⅰ结合熔解曲线分析是一种简单、快速、准确的分析GSTM1基因多态性的方法.
关键词： SYBR Green Ⅰ 熔解曲线分析 基因 多态性 -
人RORγt mRNA实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用
目的: 建立检测人RORγt(retinoid-related orphan receptor gammat) mRNA的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR, qRT-PCR)方法.方法: 根据人RORγt mRNA的保守序列设计特异性引物,提取经PMA和离子霉素刺激的人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)总RNA,并逆转录成cDNA,与pMD-18T载体连接构建质粒标准品.采用qRT-PCR方法检测RORγt mRNA水平,并评价该方法的线性、特异性及重复性.应用该方法检测Graves病(Graves′ disease, GD)患者外周血中RORγt mRNA的相对表达.结果:该方法标准曲线的相关系数为0.998,融解曲线分析显示单个峰,pMD18T-RORγt质粒标准品高、低拷贝数的批内、批间变异系数分别为6.5%,8.4%和9.6%,11.2%.初步研究表明GD患者组RORγt mRNA的相对表达水平明显高于健康对照组(t=-3.72, P<0.01).结论: 建立的检测人RORγt mRNA的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法灵敏、特异且重复性好,为临床应用提供了实验基础.
关键词： RORγt 实时定量PCR SYBR Green Ⅰ
