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两种分子检测技术快速诊断骨关节结核及其耐药性的研究
目的 评价两种分子检测技术——利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术(Xpert Mtb/RIF,简称"Xpert")和GenoType? MTBDRplus线性探针检测技术(简称"MTBDR")快速诊断骨关节结核及其耐药性的临床应用价值.方法 2014年3-6月连续收集北京胸科医院住院的60例疑似骨关节结核患者的脓标本,每份标本行涂片抗酸杆菌检查、MGIT960分枝杆菌培养、Xpert和MTBDR检测,培养阳性的结核分枝杆菌行绝对浓度法药物敏感性试验(DST)检测.以临床诊断参考标准(CRS)为金标准,评价Xpert和MTBDR检测脓标本中结核分枝杆菌的敏感度和特异度.以DST为金标准,评价Xpert和MTBDR检测脓中结核分枝杆菌耐药性的敏感度和特异度.结果 以CRS为金标准,涂片、培养、Xpert和MTBDR的敏感度分别为26.00％ (13/50)、48.00％ (24/50)、82.00％ (41/50)和72.00％ (36/50),10例非结核病患者脓标本4种技术检测结果均为阴性.以DST为金标准,6例RFP耐药样本中,Xpert检测RFP耐药全部阳性,MTBDR检测RFP耐药5例阳性;18例RFP敏感样本中2种技术检测结果均为阴性.7例INH耐药样本中,MTBDR检测INH耐药6例阳性;17例INH敏感样本中MTBDR技术检测结果均为阴性.结论 Xpert和MTBDR检测脓标本中结核分枝杆菌的敏感度和特异度高,并且可同时检测其耐药性,可用于早期诊断骨关节结核及其耐药性.
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牡蛎和粪便中GⅠ、GⅡ型诺如病毒实时聚合酶链反应检测方法的建立
目的 建立适用于牡蛎和粪便中快速、特异、灵敏的GⅠ、GⅡ型诺如病毒(NV)定量分型诊断方法.方法 通过对GⅠ、GⅡ型NV基因组保守序列的比对分析,设计高度特异的引物和探针,建立以TaqMan探针为基础的实时聚合酶链反应方法(TaqMan Real-time RT-PCR).结果 该方法对NV核酸检测高度特异,且GⅠ和GⅡ型之间无交叉反应,低检出限达102 copies/μl.对90份新鲜牡蛎样品和37份腹泻粪便标本分别用常规RT-PCR和笔者建立的TaqMan Real-time RT-PCR进行NV检测,发现牡蛎样品中后者的检出率明显高于前者,而粪便标本中两者无明显差别.同时对阳性标本的测序分析证实结果准确可靠.结论 研究中建立的TaqMan Real-time RT-PCR方法可用于海产品标本及粪便中NV定量及分型检测,可作为应对NV胃肠炎暴发的有效诊断方法.
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实时聚合酶链反应检测O1群和O139群霍乱弧菌方法的建立及应用
目的 建立检测O1群和O139群霍乱弧菌的实时荧光聚合酶链反应(RT-PCR)方法并进行水体标本的检测评价.方法 根据O1群和O139群霍乱弧菌O抗原编码基因rfb序列设计引物,利用SYBR Green染料,建立同时检测霍乱弧菌O1群和O139群的RT-PCR方法,对所建立的方法分别进行实验室内的灵敏度、特异性及重复性评价.采集河口水标本增菌后进行RT-PCR检测,与分离培养方法比较评价实际应用价值.结果 建立了检测O1群和O139群霍乱弧菌的双重RT-PCR方法,根据扩增产物的溶解温度能有效区分O1群和O139群霍乱弧菌两种目标片段的扩增;对其他10种弧菌染色体DNA没有扩增;RT-PCR检测524份河口水体标本的增菌液,与常规分离方法相比显示了明显的灵敏性,并且所有常规分离方法阳性标本其荧光PCR检测亦为阳性.结论 以O1群和O139群rfb基因为目标检测片段建立的霍乱弧菌RT-PCR方法可用于环境水体样本中霍乱弧菌常规分离前的快速筛查.
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8-O-乙酰哈巴苷防治EB病毒感染的体内外药效学研究
目的 通过体内外试验对8-O-乙酰哈巴苷防治Epstein-Barr病毒(EBV)感染的药效作用进行评价.方法 采用实时荧光定量PCR(Real-time RT-PCR)技术观察8-O-乙酰哈巴苷对B95-8细胞内EBV衣壳抗原(VCA)的抑制作用;采用腹腔注射醋酸(HAc)所致小鼠腹腔毛细血管通透性增高模型检测8-O-乙酰哈巴苷对炎症早期的毛细血管通透性亢进和渗出的抑制作用.结果 8-O-乙酰哈巴苷大、中、小剂量组对B95-8细胞内EBV衣壳抗原均具有明显的抑制作用(P＜0.01);8-O-乙酰哈巴苷大、中两个剂量组显著抑制醋酸引起的小鼠腹腔毛细血管通透性增高(P＜0.01).结论 8-O-乙酰哈巴苷对EBV感染具有明显的抑制作用.其不仅对EBV衣壳抗原具有明显的抑制作用,并且可以减轻炎症早期的毛细血管通透性亢进和渗出现象.
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TaqMan MGB探针实时聚合酶链反应检测白纹伊蚊体内登革病毒
目的初步研究TaqMan MGB探针实时聚合酶链反应(TaqMan MGB Real-time PCR)检测白纹伊蚊登革病毒的敏感性,建立一种敏感、特异、重复性好的登革病毒(Dengue virus,DV)鉴定方法.方法在实验室使雌性白纹伊蚊人工感染Den-2型病毒,设不同的感染蚊虫浓度(只/500μl或只/1 000μl)和不同的分组方法(不加未染毒的蚊虫、分别用未染毒的实验室饲养的雌性白纹伊蚊补加到每份标本10、25、50只/组),利用一步法和二步法TaqMan MGB PCR检测,根据荧光信号判断结果.结果二步法TaqMan MGB PCR可检测到标本中感染蚊虫的低浓度为2只/500μl和3只/1 000μl,一步法TaqMan MGB PCR可检测到标本中感染蚊虫的低浓度为5只/500μl,蚊自身的RNA对登革病毒RNA的检测敏感性并无明显的影响.结论 TaqMan MGB探针检测白纹伊蚊体内的DV敏感度高,特异性好,是白纹伊蚊携带登革病毒指数较理想的监测方法,标本较好的处理方法为500 μl标本处理液研磨20～30只/组,TaqMan MGBReal-time PCR好采用二步法.
关键词： 白纹伊蚊 登革-2型病毒 Taqman MGB探针 实时聚合酶链反应 -
两种PCR方法检测白纹伊蚊体内登革热2型病毒的比较研究
目的 比较TaqMan MGB探针实时聚合酶链反应(TaqMan MGB Real-time PCR)和巢式反转录聚合酶链反应(巢式RT-PCR)检测白纹伊蚊体内登革热病毒(Dengue virus,DV)的敏感性差异,建立一种敏感、特异、重复性好的DV鉴定方法.方法 在实验室使雌性白纹伊蚊人工感染Den-2,在50只/组情况下,设不同的感染蚊虫浓度(只/1000μl),利用TaqMan MGB Real-time PCR和巢式RT-PCR检测,根据荧光信号和电泳判断结果.结果 二步法TaqMan MGB Real-time PCR可检测到标本中感染蚊虫的低浓度为3只/1000 μl,一步法TaqMan MGB Real-time PCR和巢式RT-PCR可检测到标本中感染蚊虫的低浓度为5只/1000 μl.结论 二步法TaqMan MGB探针检测白纹伊蚊体内的DV敏感度高,特异性好,快速、科学,是白纹伊蚊携带DV指数较理想的监测方法.
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SYBR GreenⅠ实时PCR检测乙脑病毒方法的建立与初步应用
目的 建立一种快速、特异的SYBR Green Ⅰ实时PCR方法检测流行性乙型脑炎(乙脑)病毒.方法 对SYBR Green Ⅰ实时PCR检测乙脑病毒方法的反应条件、反应体系进行优化,同时与传统RT-PCR方法进行灵敏度比较,提高该方法的特异性、灵敏性.并用该方法对乙脑病毒毒株、登革病毒(Ⅰ～Ⅳ型)毒株、90份猪血清标本进行检测.结果 SYBR Green Ⅰ实时PCR与传统RT-PCR检测乙脑病毒方法的灵敏度无明显区别,但检测时间缩短了1/2.该方法可检测出乙脑病毒,不能扩增登革病毒,对90份猪血清标本检测结果均为阴性.结论 建立的SYBR Green Ⅰ实时PCR方法用于乙脑病毒检测具有特异、灵敏、快速等优点,可用于乙脑的病原学监测.
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Th17细胞相关因子在子痫前期和正常妊娠孕妇外周血和胎盘中表达量的对比
目的：通过对子痫前期及正常妊娠的孕妇外周血及胎盘组织中 Th17细胞相关因子 IL-17、IL-21、IL-22、HLA-G及 RORc表达量的检测以及 miRNA-21相对表达量的比较，探讨 Th17细胞相关因子以及 miRNA-21在子痫前期发病中的作用。方法选取2012年3月至2014年5月镇江妇幼保健院的40例孕妇为研究对象，其中子痫前期孕妇20例，正常孕妇20例，采用流式细胞仪分别检测子痫前期组和正常对照组外周血中 Th17细胞的水平，采用实时定量 PCR法检测外周血和胎盘组织中 Th17细胞相关细胞因子 IL-17、IL-21、IL-22、HLA-G、RORc 的表达量和相对表达量，采用实时定量 PCR法检测胎盘组织中 miRNA-21的相对表达量。结果初步证实子痫前期患者和正常妊娠女性外周血 Th17细胞相关细胞因子 IL-17、IL-21、IL-22、HLA-G、RORc 水平之间存在差异，子痫前期患者和正常妊娠女性胎盘组织中 Th17细胞相关细胞因子 IL-17、IL-21、IL-22、RORc、HLA-G水平存在差异。⑴子痫前期患者的 IL-17、IL-21、IL-22的相对表达量明显高于正常对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。⑵子痫前期组的 HLA-G、RORc的相对表达量明显低于正常对照组，差异有统计学意义（P <0.05）。⑶子痫前期组的 miRNA-21的相对表达量明显高于正常对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。⑷各项指标之间及各检测指标与临床指标间存在相关性。结论 Th17细胞相关细胞因子 IL-17、IL-21、IL-22、HLA-G、RORc 水平在子痫前期的发病过程中可能发挥重要作用，通过对相关指标的监测可能预测子痫前期的发生和监测病情变化，阻断这一途径就有可能有效预防和治疗子痫前期。
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双通道实时荧光PCR熔解曲线法检测结核分枝杆菌药物耐药相关基因突变
目的 基于双标记荧光探针熔解曲线分析技术,建立一种利用实时荧光PCR快速检测结核分枝杆菌耐药突变的方法.方法 根据结核分枝杆菌一线药物常见耐药突变位点(包括rpoB 81 bp耐药决定区、inhA启动子、katG315、ahpC启动子以及embB306)设计6条荧光双标记探针和对应引物,通过PCR扩增耐药突变位点所在基因片段,在扩增完成后通过熔解曲线检测分析实现对耐药突变的快速检测.通过对2008年上海市疾控中心收集的76株临床耐多药(MDR)菌株进行检测,验证本方法的敏感度和特异度.结果 本方法成功从76株MDR菌株中检测出相关耐药突变,各种突变对应ATm值范围为1.8～14.4℃.将检测结果和测序结果对比表明该方法检测敏感度和特异度都为100％(rpoB,80/80:inhA,7/7；katG315,59/59；ahpC,8/8；embB306,27/27).本方法可以成功从低浓度为100拷贝/μl的结核分枝杆菌DNA样本中准确地检测耐药突变.结论 双通道实时荧光PCR熔解曲线法可以快速灵敏地检测结核分枝杆菌常见耐药突变.该方法具有检测迅速准确、结果易判读、交叉污染概率低等特点,可用于快速检测临床结核耐药相关的基因突变,并对结核耐药情况进行评估.
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实时PCR在侵袭性曲霉病中的诊断价值
目的 探讨实时(Real-time) PCR在侵袭性曲霉病(IA)高危患者中的诊断价值,与血清半乳甘露聚糖(GM)试验比较诊断性能.方法 回顾性调查分析2008年5月至2010年12月临床疑患IA住院患者110例次,根据诊断标准将确诊IA和临床诊断IA归为感染组,共23例次,拟诊IA和非IA归为非感染组,共87例次.对其住院期间的257份血清进行Real-time PCR和GM检测,绘制Real-time PCR的受试者操作曲线(ROC),计算ROC曲线下面积,制定佳临界值；计算单次PCR阳性在不同分级诊断中的阳性率；计算不同PCR和(或)GM诊断条件下的灵敏度(Se)、特异度(Sp)、阳性预测值(PPV)和阴性预测值(NPV)等.采用McNemar配对x2检验对不同方法进行比较.结果 ROC曲线下面积为0.91 (95％ CI:0.825 ～0.995),佳临界循环值为39.45.单次PCR阳性对确诊和临床诊断的诊断率分别为100％和84.2％.以单次PCR阳性、两次PCR阳性、单次GM阳性和两次GM阳性为诊断标准的Se和Sp分别为87.0％、79.3％,58.3％、97.8％,78.3％、63.2％和58.3％、82.6％.以单次、两次PCR阳性为诊断标准的Sp分别较单次、两次GM阳性显著升高(P＜0.05),而Se无统计学差异；两次PCR阳性与单次PCR阳性相比Sp显著升高(P＜0.05).1次GM阳性且1次PCR阳性的Se、Sp为65.2％、89.7％；1次GM阳性或1次PCR阳性Se达100％,Sp为52.3％.结论 Real-time PCR对侵袭性曲霉病具有较高的诊断价值,其灵敏度和特异度均优于GM试验；两次PCR阳诊断侵袭性曲霉病能够提高诊断的特异度和阳性预测值.
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LDR-ULP 结合荧光定量 PCR 快速检测β-地中海贫血的应用研究
目的：以6种临床常见突变型为研究对象，建立一种快速检测β-地中海贫血的新方法。方法收集重庆市大坪医院2015年1至12月正常野生型标本50份和6种临床常见突变型标本42份，PCR扩增外周血β-珠蛋白基因，扩增产物与独立设计的连接检测反应-制式连接探针（ LDR-ULP）体系杂交后，荧光定量PCR检测突变类型，琼脂糖电泳验证检测结果，标本梯度稀释法分析LDR-ULP结合荧光定量PCR方法的灵敏度， Kappa检验分析与反向膜杂交法的检测一致性。结果LDR-ULP杂交反应与多重连接探针扩增技术（ MLPA）相比可提高杂交效率2.53倍，经荧光定量PCR扩增后，6种临床常见突变型均出现了明显的扩增曲线，而正常野生型则在40个循环内均无明显扩增曲线。本方法在DNA标本大于5 pg范围内均能得到明显的扩增曲线，对92份临床外周血标本DNA进行检测，本研究方法与反向膜杂交方法结果一致率为100％。结论本研究通过LDR-ULP技术的特异性，结合荧光定量PCR方法的灵敏性和实时快速的特点，建立了一种操作简便、价格低廉、检测快速的β-地中海贫血的检测新方法。（中华检验医学杂志，2016，39：766-770）
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血清miR-122-5 p和miR-486-5 p在肝癌诊断中的临床应用
目的 探讨肝癌患者血清miR-122-5p和miR-486-5p的表达水平,及两指标单独或与甲胎蛋白(AFP)联合诊断肝癌的临床应用价值.方法 采用病例对照研究.选择2016年6月至2017年3月在广州军区广州总医院住院的60例肝癌患者(HCC组),20例肝炎患者(肝炎组),20例肝硬化患者(肝硬化组),20例乳腺癌患者(乳腺癌组),20例胃癌患者(胃癌组)及20名健康体检人员(正常对照组),提取总RNA,采用实时荧光定量PCR技术,检测血清中miR-122-5p和miR-486-5p的相对表达量.用受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic,ROC)分析miRNA对肝癌诊断的特异度和灵敏度,并与肿瘤标志物AFP的测定结果进行比较.根据ROC曲线下面积判断诊断效能,评估其在肝癌诊断中的应用价值.各组间比较采用非参数秩和检验进行分析.结果 肝癌组、肝炎组、肝硬化组、乳腺癌组、胃癌组及健康对照组中血清miR-122-5p的相对表达量分别是0.14(0.05～0.51)、0.45(0.32～0.58)、0.53(0.34～0.67)、0.14(0.07～0.28)、0.29(0.13～0.36)和0.73(0.63～0.95),血清miR-486-5p的相对表达量分别是0.50(0.23～0.77)、0.62(0.48～0.82)、0.65(0.54～0.85)、0.23(0.08～0.40)、0.29(0.15～0.45)和0.76(0.69～1.23).肝炎组、肝硬化组、肝癌组中血清miR-122-5p的相对表达量较健康对照组低,差异均有统计学意义(U值分别为315.37,393.46,429.08,P均<0.01),肝炎组、肝硬化组、肝癌组中血清miR-486-5p的相对表达量较健康对照组较低,差异均有统计学意义(U值分别为103.67,156.18,207.35,P均<0.05).单项检测HCC时,AFP的敏感度高(73.7％),miR-122-5p的特异度高(95％).双项检测HCC时,AFP+miR-122-5p的敏感度高(93％),miR-122-5p和miR-486-5p的特异度高(70％),AFP+miR-122-5p的联合检测与单项AFP相比,AUC差异有统计学意义(Z=3.02,P<0.01),而AFP+miR-486-5p及miR-122-5p+miR-486-5p较AFP单项检测AUC差异无统计学意义(Z=1.57,1.39,P均>0.05).三项联合检测时,敏感度和特异度分别为96.5％和55％,ROC曲线下面积AUC为0.891(95％CI:0.818～0.964),三项联合检测时高于单独检测,且与AFP、miR-122-5p及miR-486-5p相比,AUC差异均有统计学意义(Z=3.26,3.72,4.25,P均<0.01).结论 血清miR-122-5p和miR-486-5p有可能成为肝癌辅助诊断的血清学标志物.
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TaqMan MGB蛋白探针法检测IL28brs12979860位点基因多态性
目的 建立一种TaqMan real-time PCR探针杂交法,用于快速检测人rs12979860位点多态性.方法 从人各不同组织器官中提取基因组DNA,利用小沟结合蛋白(MGB)探针的高度特异性,设计相应的引物探针,根据实时荧光定量PCR过程中产生的信号在2个检测通道的强弱变化来鉴别等位基因差异.后所测样本经DNA测序验证结果的准确性.采用x2检验进行统计分析.结果 利用TaqMan MGB蛋白作为探针,能够区分只有1个碱基差异的目标基因组片段.该方法低检测浓度为1.5 ng/μl,扩增有效率达97.6％.不同组织器官(肾、心脏、子宫、血浆)及分泌物(鼻咽部)的DNA均可以用于检测.在随后对40例高加索人和50例黄种人的检测中亦证实,rs12979860位点的基因型及等位基因频率存在差异,高加索人以CT基因型为主(26/40),而黄种人以CC基因型为主(40/50),差异有统计学意义(x2=18.75,P＜0.05).在两种族人群中,抗病毒治疗血清学转换与患者基因型之间差异无统计学意义(P均＞0.05).结论 TaqMan MGB法能快速并准确地区分rs12979860位点多态性,具有高度特异性和灵敏度,适用于多种样本的临床检测,是对丙肝患者抗病毒个体化治疗进行遗传分析的理想工具.
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TaqMan－MGB 实时荧光定量 PCR 检测 RIG－G基因方法的建立及其方法学验证
目的：建立一种以TaqMan－MGB荧光探针为特点，检测人类急性早幼粒细胞白血病（ M3型）中维甲酸诱导基因G（ RIG－G）的实时荧光定量聚合酶链反应（ RT－qPCR）方法，并运用该方法对正常人、M3患者外周血中的RIG－G表达水平进行分析，探讨其在M3诊断中的价值。方法方法学建立。针对人RIG－G基因设计特异性引物和TaqMan－MGB荧光探针，以逆转录的互补DNA为模板，建立TaqMan－MGB实时荧光定量PCR检测方法和标准曲线；在方法特异性、正确度、精密度、分析灵敏度、干扰物质等各方面对检测方法的性能进行评估，并用该法验证20例M3患者外周血与骨髓中RIG－G表达水平相关性，同时检测40份正常人及20份M3患者标本，t检验比较两组外周血RIG－G水平，用ROC曲线分析其对M3的检测效能。结果 RIG－G标准品拷贝数log值与循环阈值数（ Ct ）的标准曲线方程为：Y＝－3．539X＋42．952，R2＝0．999，呈良好的线性关系。用建立的实时荧光定量PCR方法检测标准品，结果与已知值比较，相关性系数r＝0．999，计算偏倚值均＜5％；分别选取高值（107拷贝／μl）、中值（104拷贝／μl）、低值（101拷贝／μl）3个浓度，批内CV分别为1．38％、2．31％、7．56％；批间CV分别为0．71％、1．17％、5．07％，均＜10％；该方法的分析灵敏度为101拷贝／μl。 M3患者外周血与骨髓中RIG－G表达水平相关系数为r＝0．996，斜率b＝0．973，结果相关性良好，t＝0．099，P＞0．05，显示两组标本检测结果差异无统计学意义。40份正常健康体检外周血RIG－G基因的拷贝数[3．62×104（1．61×104～4．90×104）拷贝／μl]与M3患者[7．10×102（5．43×102～2．21×103）拷贝／μl]差异有统计学意义（U＝18，P＜0．001）。结论成功建立了检测人外周血RIG－G基因的TaqMan－MGB荧光实时定量PCR方法。该法具有较好的正确度、精密度、灵敏度及特异性，能够为临床M3患者的早期诊断及治疗监测提供必要帮助。（中华检验医学杂志，2016，39：936－940）
关键词： 实时聚合酶链反应 细胞内信号肽和蛋白质类 白血病 早幼粒细胞 急性 -
抗菌药物浓度对整合子内耐药基因盒重组效率影响的研究
目的 研究在不同浓度链霉素下,aadA2基因盒在整合子attI位点的整合频率.方法将已知序列的1类整合子克隆到pACYC184质粒,该重组质粒命名为pACIDA;将该整合子上的整合酶基因克隆到pET28a质粒,该重组质粒命名为pETINT;这两重组质粒依次转化大肠杆菌BL21(DE3).转化后的大肠杆菌在加不同浓度的链霉素的LB液体培养基中,37℃过夜培养.使用荧光定量PCR技术分别测定aadA2基因盒在attI位点发生整合作用的整合子的拷贝数和总整合子的拷贝数,前者除以后者即可获得整合频率.结果高表达整合酶的情况下,在加入的链霉素浓度分别为0、20、30、40、50μg/ml时,aadA2基因盒在attI位点的整合频率依次为(1.97±0.24)×10-3、(3.23±1.77)×10-3、(3.27±0.67)×10-3、0.45±0.13、1.32±0.11.而在没有整合酶高表达的情况下背景频率低于(1.75±0.33)×10-7.结论高浓度的链霉素能够促进整合子中aadA2基因盒在整合子中attI位点的重组效率.
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利用实时荧光定量 PCR 分析孕中期羊水细胞 SMN1基因缺失
目的：探讨采用羊水样本进行脊髓性肌萎缩症（ SMA）产前诊断的方法。方法利用基于短串联重复序列（ STR）遗传标记的分子检测技术对2015年1月至2016年1月4家医院1064份孕中期妇女羊水进行母血污染检测，对无母血污染的羊水样本采用实时荧光定量PCR进行SMN1基因缺失情况检测，多重连接探针扩增（ MLPA ）验证实时荧光定量PCR 的SMN1基因检测结果。结果1064份孕中期妇女羊水经STR分型检测，2份存在母血污染，其余1062份无母血污染的羊水样本经实时荧光定量PCR检测结果显示，39例孕妇胎儿存在SMN1基因第7外显子（ E7）杂合缺失（3．67％），34例孕妇胎儿存在SMN1基因第8外显子（E8）杂合缺失（3．2％），2例孕妇胎儿存在E7纯合缺失、E8纯合缺失（0．19％），其余病例E7、E8均未发现缺失。 MLPA对41例SMN1杂合或纯合缺失样本以及55例未检出SMN1缺失样本验证结果均与实时荧光PCR检测结果一致。结论实时荧光定量PCR及MLPA均可用于对孕中期妇女胎儿的SMN1基因缺失情况的检测，实时荧光定量PCR样本需求量少，检测更快速。（中华检验医学杂志，2016，39：418－422）
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脊髓性肌萎缩症的三种基因诊断方法比较
目的 评估限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)、实时荧光定量PCR及多重连接探针扩增技术(MLPA)在脊髓性肌萎缩症(SMA)基因诊断中的应用价值,为该病分子诊断方法的选择提供参考.方法 方法学评价.收集2013年3月至2014年6月就诊于上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心的41例SMA疑似患者及359名健康人外周静脉血,抽提基因组DNA.分别采用上述3种临床常用运动神经元存活基因1(SMN1)缺失变异检测方法对各样本进行SMN1第7和第8外显子缺失变异分析,比较3种方法的检测效果.结果 荧光定量PCR结果与MLPA结果一致,显示疑似病例中29例患者存在纯合缺失,1例为杂合缺失携带者,其中27例为SMN1外显子7+8纯合缺失,2例为第7外显子纯合缺失,正常对照标本中5例为杂合缺失,其余病例及对照均为未缺失.对于纯合缺失及未缺失标本,PCR-RFLP与上述2种方法检测结果相同,但RFLP方法未能检测出杂合缺失.结论 PCR-RFLP方法简便但无法判断杂合缺失,MLPA可相对定量且准确度高,但价格较高难以用于人群筛查.相较于两者,荧光定量PCR检测周期短、通量大,结果为标准判读,准确性高,在SMA的分子诊断尤其是携带者筛查中具有较大优势.
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PNPLA3基因rs738409检测方法的建立及其与非酒精性脂肪肝的相关性分析
目的：建立rs738409（C＞G）多态性实时荧光定量PCR分型方法，并探讨rs738409多态性与非酒精性脂肪肝（ NAFLD）的相关性。方法方法学建立及遗传易感性分析。采用等位基因特异性引物，以TaqMan探针作为检测信号，根据Ct值的差值ΔCt（ΔCt＝C等位基因引物反应体系Ct值-G 等位基因引物反应体系Ct值），建立扩增受阻突变体系-TaqMan（ARMS-TaqMan）实时荧光定量PCR等位基因分型方法，并采用所建方法对航天中心医院2014年1至12月健康体检人员618名（男性401名，女性217名）的rs738409进行分型检测。脂肪肝采用B型超声进行检测。 rs738409多态性与NAFLD的相关性采用χ2检验和多变量Logistic 回归分析。结果618名研究对象中NAFLD患病率为30．1％（186例），其中男性147例，女性39例；432名非NAFLD者（男性254名，女性178名）。ARMS-TaqMan方法检测的CC型ΔCt＝-13．1±1．4（243名），CG型ΔCt＝0．01±0．41（282名），GG型ΔCt＝13．0±1．5（93名）。 NAFLD 患者组的 GG 型等位基因（21．5％）显著高于非 NAFLD 组（12．3％）（χ2＝8．677， P＝0．003）。控制性别、年龄、总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、空腹血糖和体重指数后，与CC型比较，CG型和GG型发生NAFLD风险的OR值（95％CI）分别为1．35（0．91～2．00）和2．21（1．32～3．71）（P＝0．013）。肝酶丙氨酸氨基转移酶（ALT）的水平在3组间差异有统计学意义（F＝8．980， P＜0．001），GG型的天冬氨酸氨基转移酶（AST）的水平显著高于CC型（F＝6．491， P＜0．001）。结论 rs738409 ARMS-TaqMan分型方法具有准确、一步检测、高通量等特点。 rs738409 G等位基因是NAFLD遗传易感性的危险因素，并与肝酶ALT、AST升高具有显著相关性。（中华检验医学杂志，2016，39：45-49）
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无需抽提RNA直接定量血浆microRNAs的实时荧光定量PCR方法的建立与评价
目的 建立无需抽提RNA直接以血浆中的microRNAs (miRNAs)作为模板进行实时荧光定量PCR检测的新方法.方法 方法学建立.采集健康人EDTA-K2抗凝静脉血并分离血浆,取7.5μl血浆用等量含2.5％(体积比)Tween20的缓冲液处理后进行逆转录及PCR,建立血浆miRNAs直接检测法.用该方法检测健康人血浆标本中U6 snRNA、miR-24-1-5p和miR-4634表达水平,评估其扩增的特异性和扩增效率.同时与传统的抽提RNA定量PCR检测法的阈值循环数(Cq)值进行比较并作相关性分析.另外,应用建立的血浆直接检测法,比较了混合引物和单个引物逆转录法检测健康人血浆标本中U6 snRNA、miR-24-1-5p和miR-4634结果的一致性.结果 血浆直接检测法融解曲线显示健康人血浆标本中U6、miR-24-1-5p和miR-4634扩增产物分别在81、83、84.2 qC时出现单一峰,无引物二聚体峰和其他非特异峰出现.血浆直接检测法检测miR-24-1-5p扩增效率为1.1,同一份样本中U6、miR-24-1-5p和miR-4634这3种基因的扩增曲线平行,说明扩增斜率一致.直接检测法检测miR-4634的Cq值为30.98±0.17,高于RNA抽提法的29.22±0.21,差异有统计学意义(t=8.475,P＜0.01),而2种方法检测U6(直接检测法32.43±0.08,RNA抽提法32.57±0.06;t=1.354,P＞0.05)、miR-24-1-5p(直接检测法20.73±0.14,RNA抽提法21.06±0.21；t=1.749,P＞0.05)结果差异均无统计学意义.2种方法检测U6(r=0.860 5,P＜0.01)、miR-24-1-5p(r=0.728 9,P＜0.05)和miR-4634(r=0.748 5,P＜0.01)结果具有较好的相关性.混合引物和单个引物逆转录后PCR的Cq值之间无明显差异.结论 建立的血浆直接检测法只需对血浆标本进行简单的预处理,并可使用混合引物进行逆转录定量PCR,具有操作简便、检测成本低等优点,值得进一步推广应用.
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血浆 miR-199a-5p 与 miR-200c-3p在胃腺癌中的临床应用
目的：探讨胃腺癌患者血浆中miR-199a-5p、miR-200c-3p的表达及其对胃腺癌诊断和预后判断的临床意义。方法采用病例对照研究方法，对2013年9月至2014年7月在南京医科大学附属肿瘤医院住院的47例胃腺癌患者及50名健康对照者进行研究，应用实时荧光定量PCR技术（TaqMan探针法）检测血浆中miR-199a-5p和miR-200c-3p的表达水平，分析其与年龄、性别、肿瘤定位、大小、分化程度、TNM分期、淋巴结转移等病理参数的关系，并比较30例胃癌根治术前及术后6～8天血浆中 miRNAs 表达的变化情况；应用受试者工作特征曲线（ receiver operating characteristic， ROC）分析miRNAs的表达对胃癌诊断的灵敏度和特异性。采用SPSS20.0统计学软件进行统计分析，正态分布的计量资料采用t检验，术前术后对比采用配对t检验，多组间比较采用单因素方差分析。结果 miR-199a-5p在胃癌患者血浆中的相对表达量为（1.05±0.22），与对照组（26.80±8.38）相比，显著降低（t＝3.058，P＝0.003），且与淋巴结转移（F＝4.725，P＝0.029）及肿瘤分化程度（F＝3.854，P＝0.032）相关。而miR-200c-3p在胃癌患者血浆中相对表达量为（15.15±3.02），与对照组（3.39±0.87）相比，显著升高（t＝－2.854，P＝0.006）。 MiR-199a-5p在术后表达增高（t＝－3.814，P＝0.001）而miR-200c-3p在术后表达降低（t＝2.978，P＝0.006）。 ROC曲线分析表明血浆miR-199a-5p、miR-200c-3p、miR-199a-5p和miR-200c-3p曲线下面积（ AUC）分别是0.692、0.792、0.798；三者的敏感性分别是87％、97％、92.5％；特异性分别是43％、54％、65％。结论 MiR-199a-5p和miR-200c-3p对胃腺癌的联合检测具有较高的灵敏度和特异性。（中华检验医学杂志，2015，38：402-406）
