甩片改良抗酸法与 FQ-PCR 技术在脑脊液抗酸菌检查中的应用分析

目的：评价脑脊液改良抗酸染色法与实时荧光定量聚合酶链反应（fluorescence quantitative polymerase chain reaction，FQ-PCR）法诊断结核性脑膜炎（tuberculous meningitis，TBM）的意义。方法 TBM 患者81例，采集脑脊液检测标本，分别采用离心甩片改良抗酸染色法、实时 FQ-PCR 法检测抗酸杆菌。结果81例改良抗酸染色法阳性率66．7％（54／81）高于 FQ-PCR 方法阳性率50．6％（41／81），差异有统计学意义（P ＜0．05）。结论在诊断 TBM 方面，改良抗酸染色方法显著优于 FQ-PCR 方法。

脑脊液细胞计数与实时荧光定量 PCR 检测结核菌在结核性脑膜炎诊断中的相关性分析

目的：分析结核性脑膜炎（tuberculous meningitis，TBM）脑脊液细胞数变化，探讨其与脑脊液中结核分枝杆菌实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescent quantitative PCR，FQ-PCR）检测阳性的相关性。方法选取确诊的结核性脑膜炎患者81例，应用全自动血液－体液细胞分析仪进行脑脊液细胞总数计数、离心甩片作脑脊液细胞涂片，光学显微镜图像分析系统分类计数，应用 FQ-PCR 法检测脑脊液中结核分枝杆菌，两者进行相关性分析。结果 FQ-PCR 法检测 TB-DNA 阳性率为50．6％（41／81），其中 FQ-PCR 阳性组中白细胞总数高于阴性组（P ＜0．05）。且白细胞数与 FQ-PCR 拷贝数呈正相关。FQ-PCR 阳性中脑脊液细胞学表现：以混合型细胞反应为主，其中淋巴细胞比例0．590，中性粒细胞比例0．366。结论结核性脑膜炎脑脊液细胞学大多以淋巴细胞反应为主，脑脊液白细胞数的变化可以反映疾病的严重程度，与 FQ-PCR 联合检测对早期诊断结核性脑膜炎有一定的意义。

MicroRNA-3198、microRNA-8084、microRNA-7515和microRNA-3613-3 P在卵巢癌中的表达及临床意义

目的 比较miRNA-3198、miRNA-8084、miRNA-7515和miRNA-3613-3P在初治卵巢癌原发灶、转移灶、复发卵巢癌和卵巢上皮性良性肿瘤组织中的表达情况.方法 选取2010年10月—2016年11月就诊于解放军白求恩国际和平医院妇产科的卵巢肿瘤患者60例,根据术后病理类型分为初治卵巢癌原发灶组织(A组)15例、初治卵巢癌转移灶组织(B组)15例、复发卵巢癌组织(C组)16例和卵巢上皮性良性肿瘤组织(D组)14例.利用qRT-PCR方法检测卵巢上皮性肿瘤组织中4种miRNA的表达情况.结果 miRNA-3198、miRNA-7515、miRNA-8084分别在A、B和C组中均为低表达(P<0.05),miRNA-3198在A组中表达水平低.miRNA-3613-3P在A组和C组中均为低表达(P<0.05).结论 miRNA-3198可能在卵巢癌的发生发展、转移及复发过程中均有一定作用,miRNA-7515和miR-NA-8084可能参与卵巢癌的发生,miRNA-3613-3P可能参与卵巢癌的转移与复发.

肝癌中NDRG2、AKT2 mRNA及其磷酸化蛋白的表达

目的：检测不同病理级别原发性肝细胞癌中N-myc下游调节基因2( NDRG2)和蛋白激酶B2( AKT2) mRNA及其磷酸化蛋白的表达水平。方法收集不同病理级别原发性肝细胞癌组织及癌旁正常肝组织标本各30例,检测标本中NDRG2、AKT2 mRNA及其磷酸化蛋白的表达情况,并对其间的相互关系进行分析。结果30例原发性肝细胞癌组织中NDRG2 mRNA表达低于瘤旁组织(P<0．05),AKT2 mRNA与瘤旁组织无明显差异(P>0．05),两者均与病理级别无关(P>0．05),且NDRG2与AKT2表达无相关性(P>0．05)。在高表达474位丝氨酸磷酸化的AKT2蛋白(P-AKT2-SER474)分子的标本中,两个NDRG2磷酸化分子多为低表达,相反,在低表达P-AKT2-SER474分子的标本中,两个NDRG2磷酸化分子多为高表达。结论在mRNA表达水平,还不能认为NDRG2与AKT2之间有相关性。在蛋白质水平,NDRG2的磷酸化不依赖于AKT2的磷酸化,且NDRG2与AKT2的磷酸化作用可能存在竞争关系。

宫颈癌组织中受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶4高表达与宫颈癌预后的相关性分析

目的 探讨受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶4(RIPK4)在宫颈癌组织中表达水平及与宫颈癌临床病理参数的相关性.方法 研究对象是39例宫颈癌患者,收集所有宫颈癌患者癌组织和癌旁正常组织.应用实时定量聚合酶链反应(PCR)方法检测宫颈癌组织及正常宫颈组织中RIPK4 mRNA表达水平.应用免疫组织化学方法检测宫颈癌组织及正常宫颈组织中RIPK4蛋白表达水平.分析宫颈癌组织中RIPK4表达与宫颈癌临床病理参数相关性.结果 正常组织中 RIPK4 mRNA表达水平是1.5 ± 0.8;宫颈癌组织中 RIPK4 mRNA表达水平是4.3 ± 1.6,宫颈癌组织中RIPK4 mRNA表达水平显著增高(P<0.05).RIPK4蛋白在正常宫颈组织中表达阴性;RIPK4蛋白在宫颈癌组织中表达阳性,其中14例(36%)宫颈癌患者RIPK4蛋白表达弱阳性,25例(64%)宫颈癌患者RIPK4蛋白表达强阳性.统计分析显示,国际妇产科联盟(FIGO)分期和淋巴结转移与宫颈癌组织中RIPK4高表达显著相关(P <0.05).结论 宫颈癌组织中RIPK4高表达与FIGO分期和淋巴结转移显著相关.

miR-210在化疗耐药与化疗敏感卵巢浆液性癌组织中的检测及意义

目的 检测化疗耐药与化疗敏感卵巢浆液性癌组织中miR-210差异表达情况,探讨其参与卵巢浆液性癌耐药形成的分子机制.方法 选取化疗耐药与化疗敏感卵巢浆液性癌组织标本各20例,利用实时PCR方法验证化疗耐药与化疗敏感卵巢癌组织中miR-210的差异表达情况;应用生物信息学软件预测miR-210潜在靶基因;分析miR-210在卵巢浆液性癌组织中的表达水平与卵巢浆液性癌患者绝经前后、手术病理分期、组织学分级和有无淋巴结转移的关系;采用受试者工作特征曲线分析miR-210对化疗耐药与化疗敏感卵巢浆液性癌患者的诊断意义,并计算灵敏度、特异度、误诊率、漏诊率、阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比和阴性似然比.结果 实时PCR方法显示,miR-210在卵巢浆液性癌化疗耐药组织中表达水平显著高于化疗敏感组织(P＜0.05).生物信息学分析软件预测miR-210潜在靶基因为HOXA9、FGFRL1、EFNA3、VEGF、E2F3.miR-210的表达与卵巢浆液性癌及其中化疗耐药和化疗敏感卵巢浆液性癌患者绝经前后、手术病理分期、组织学分级和有无淋巴结转移均无明显相关性(均P＞ 0.05).miR-210的表达对诊断卵巢浆液性癌化疗耐药有中等准确性(Az=0.855),优截断点为1.043.在优截断点的灵敏度和特异度分别为95.0％和60.0％,误诊率和漏诊率分别为40％和5％,阳性预测值和阴性预测值分别为70.4％和92.3％,阳性似然比和阴性似然比分别为2.375和0.083.结论 miR-210与卵巢浆液性癌化疗耐药有关,其可能通过靶基因HOXA9、FGFRL1等参与卵巢癌的耐药形成.miR-210的异常表达对卵巢癌化疗耐药仅有中度诊断意义.

化疗耐药及敏感卵巢癌细胞差异表达microRNA的筛查与组织鉴定

目的 探讨microRNA在卵巢浆液性癌化疗耐药及敏感组织的差异表达,为卵巢浆液性癌化疗耐药的研究提供理论依据.方法 应用microRNA表达谱基因芯片,研究紫杉醇耐药卵巢癌细胞skov3-tr30及其敏感细胞skov3基因表达谱,获得表达差异的microRNA后,选取部分差异表达的microRNA用实时聚合酶链反应对化疗耐药与敏感卵巢浆液性癌组织各20例进行验证.结果 通过microRNA表达谱基因芯片方法筛选出171个与卵巢癌细胞化疗耐药相关microRNA,基因表达增高(上调趋势)69个,为miR-17、miR-19b、miR-92-1、miR-210、miR-1307等；基因表达降低(下调趋势)102个,为miR-134、miR-34、miR-196b等.miR-17～92是与卵巢癌耐药相关的microRNA之一.miR-17～92基因簇在化疗耐药卵巢浆液性癌组织中表达水平显著高于敏感组织,差异有统计学意义(P＜0.O1).miR-17～92基因簇表达与卵巢浆液性癌及化疗耐药卵巢浆液性癌患者绝经前后、手术病理分期、组织学分级、是否行淋巴结清扫术和有无淋巴结转移均无明显相关性(均P＞ 0.05).结论 microRNA表达谱基因芯片可筛查出化疗耐药及敏感卵巢癌细胞的差异表达基因,miR-17～92基因簇与卵巢浆液性癌化疗耐药有关.

多发性骨髓瘤患者外周血清中microRNA-181a和microRNA-20a表达水平的检测及其临床意义

目的:检测多发性骨髓瘤(MM)患者外周血血清中microRNA-181a和microRNA-20a表达水平,探讨microRNA-181a和microRNA-20a在MM发病过程中的临床意义.方法:选取2013年1月-2014年5月西安交通大学第一附属医院血液科住院患者作为病例组研究对象,其中MM组32例,其他血液病组12例,所有研究对象均符合《血液病诊断和疗效标准》中诊断标准且均经临床医师确诊,并排除心、肺、肝脏等其他器官衰竭且病情稳定者.同时选取同期20名健康体检者作为正常对照组.收集各组研究对象的外周血标本,采用实时荧光定量PCR方法检测血清中microRNA-181a和microRNA-20a表达情况,同步检测血清β2微球蛋白(β2-MG)水平、乳酸脱氢酶(LDH)活性、白蛋白(ALB)水平、游离轻链(FLC)水平及M蛋白百分比,并比较其差异.结果:MM组、其他血液病组和正常对照组研究对象血清中microRNA-181a和microRNA-20a表达水平分别为0.0452和5.879、0.000和0.072、0.004和1.159,3组间比较差异有统计学意义(H=15.218,9.891; P=0.000,0.007).MM组患者血清中microRNA-181a和microRNA-20a表达水平与正常对照组比较差异有统计学意义(Z=-2.702,-1.979; P=0.005,0.048),MM组与其他血液病组比较差异也有统计学意义(Z=-3.163,-2.722; P=0.001,0.005);microRNA-181a和microRNA-20a表达水平均与M蛋白百分比呈正相关关系(r=0.574,0.739; P=0.032,0.003); miR-181a表达水平与肿瘤负荷指标β2-MG和FLC呈正相关关系(r=0.552,0.780; P=0.041,0.001).结论:MM患者血清中microRNA-181a和microRNA-20a高表达,其可能参与MM的发病过程,有望成为MM诊断标志物;其中microRNA-181a可能作为判断MM患者预后不良的指标.

单纯疱疹病毒-1基因转移载体在BALB/c小鼠体内的生物分布

目的 研究单纯疱疹病毒1型(Herpes simplex virus type 1,HSV-1)基因转移载体在BALB/c小鼠体内的生物分布.方法 建立实时定量PCR反应方法,并对方法进行验证.BALB/c小鼠经肌肉注射1×107 pfu HSV-1,每隔2d给药1次,共3次.分别于末次给药后24h和63 d摘取组织脏器,采用建立的实时荧光定量PCR法检测不同组织脏器中HSV-1基因拷贝数.结果 建立的荧光定量PCR法线性范围宽,特异性强、重复性好.HSV -1基因转移载体广泛分布于各个组织器官,主要分布在背根神经节、注射部位、肺和脾脏,分布量随注射时间的延长逐渐下降.结论 HSV-1经肌肉注射后,能高效地将目的基因转运到小鼠体内的各个部位;HSV-1能为基因转移提供安全,有效的载体平台.

两种转基因载体对关节软骨细胞中内参基因转录水平的影响

目的 探讨质粒型和腺相关病毒两种转基因载体对家兔关节软骨细胞中GAPDH、B2M、18S rRNA和TUBB内参基因mRNA转录水平的影响.方法 将携带增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EFGP)报告基因的质粒型载体pcDNA6.2-EGFP和腺相关病毒载体AAV2-EGFP分别转染至体外培养的家兔关节软骨细胞中,荧光显微镜观测转染后关节软骨细胞中EGFP的表达,实时PCR技术检测两各组关节软骨细胞中GAPDH、B2M、18S rRNA和TUBB基因mRNA转录水平的变化.结果 转染48 h后,两组转基因关节软骨细胞中均可见明显的绿色荧光;与正常对照组相比,4个内参基因在两组转基因细胞内的转录水平均下调,其中GAPDH和TUBB基因下调较小,腺相关病毒载体对转基因的影响小.结论 腺相关病毒载体对关节软骨细胞中内参基因表达的影响低于质粒型载体,表明腺相关病毒对关节软骨细胞本身影响较小;GAPDH和TUBB基因可作为实验的内参基因校正目的基因的表达量.

DNA聚合酶中宿主细胞核酸残留的分析

目的 分析市售不同厂家DNA聚合酶中的宿主细胞核酸残留.方法 根据E coli 16S rRNA基因序列设计特异引物及探针,建立基于Taqman探针技术的Real-time PCR检测方法,检测基因工程制品中E.coli的核酸残留.结果 建立的Real-time PCR法检测市售不同厂家的DNA聚合酶中均有宿主细胞E.coli核酸残留,但不同来源的DNA聚合酶其宿主细胞核酸残留量不同.结论 应用PCR方法检测基因工程产品,尤其是E.coli制备的生物制品时,应注意DNA聚合酶中核酸残留对检测结果的影响;应用Real time PCR法定量检测时,建议将Ct值控制在30以内,以减小DNA聚合酶背景残留物的影响.

腮腺炎病毒临床口漱液样本的一步法实时荧光定量PCR检测

目的 建立腮腺炎病毒(mumps virus,MuV)临床口漱液样本一步法荧光定量PCR检测方法,为腮腺炎的临床诊断及免疫防控提供依据.方法 对101份采集自中国南部3个省、自治区(云南、四川、广西)的临床疑似腮腺炎患者口漱液样本,分别采用细胞培养-MuV特异的巢式PCR法及TaqMan探针Real-time PCR法进行检测,比较两种方法检测MuV的灵敏性.结果 细胞培养-MuV特异的巢式PCR法共检出31份MuV阳性样本,系统进化分析表明,该31株MuV均属于F基因亚型；TaqMan探针Real-time PCR法共检出41份MuV阳性样本,其中包含了细胞培养-MuV特异的巢式PCR法检出的31份阳性样本,TaqMan探针Real-time RT-PCR法对MuV的检出率(40.59％)高于传统细胞培养-巢式PCR法的检出率(30.69％).结论 TaqMan探针Real-time PCR法的灵敏性、特异性和简便性均优于传统的细胞培养-MuV特异的巢式PCR法,可应用于腮腺炎的临床诊断及免疫防控.

常用基因转移载体的生物分布特点

基因转移载体主要分为病毒和非病毒载体,研究其生物分布特点对于寻找毒性靶器官,评价生殖系转移危险具有重要参考价值.本文对不同种类基因转移载体的生物分布特点作—综述,为基因转移载体的选择、毒性评价等提供参考.

实时聚合酶链反应方法检测人偏肺病毒的比较研究

骨性关节炎患者血管内皮生长因子的表达

目的 检测骨性关节炎(OA)关节软骨中血管内皮生长因子(VEGF)的表达.方法 应用SYBRGreen Ⅰ实时定量聚合酶链反应(PCR)检测20例OA和10例外伤患者关节软骨中VEGF mRNA表达,并用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定关节软骨组织VEGF含量.结果在OA和对照组患者软骨组织中都存在VEGF121、VEGF165和VEGF189 3种亚型的mRNA表达,但OA的VEGF121和VEGF165表达高于对照组.ELISA定量显示,OA患者的软骨组织分泌VEGF较对照组明显升高[(31.27±7.81)ng/g总蛋白、(5.15±2.69)ng/g总蛋白,P＜0.01)].结论 VEGF在OA的发病过程中起重要的作用.

尿液多种microRNA检测方法的建立及其在膀胱癌诊断中的应用研究

目的:建立尿液中8种微小RNA(microRNA,miRNA)的检测方法,明确其分布规律及其在膀胱癌中的变化.方法:选取15名健康人的晨尿及随机尿液,以及15例确诊膀胱癌患者的随机尿液,进行总RNA提取,然后反转录得到cDNA,用荧光实时PCR法扩增8种膀胱癌相关miRNA,分别为miR-126、miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-182、miR-183、miR-429和miR-141,探讨晨尿与随机尿、尿液浓缩前与浓缩后对尿液miRNA浓度的影响.比较正常对照组与膀胱癌患者尿液中上述8种miRNA的表达差异,并采用受试者工作特征曲线分析尿液miRNA检测在膀胱癌诊断中的价值.结果:浓缩尿液组的6种miRNA(miR-126、miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-429和miR-141)浓度显著高于未浓缩组(P<0.05),而浓缩晨尿组的8种miRNA浓度与浓缩随机尿组间比较无统计学差异(P>0.05).与正常对照相比较,miR-126、miR-182、miR-183及miR-141的浓度在膀胱癌组中显著升高(P<0.05),而miR-200a浓度在膀胱癌组中显著降低(P<0.05).受试者工作特征曲线分析显示,单独检测尿液miRNA对于膀胱癌的诊断缺乏有效性,而对5种尿液miRNA(miR-126、miR-200a、miR-182、miR-183和miR-141)进行联合检测则可显著提高膀胱癌诊断的灵敏度和特异度.结论:尿液中稳定存在多种miRNA,尿液中多项miRNA的联合检测可能有望成为诊断膀胱癌的有效指标.

快速鉴定苯丙酮尿症模型小鼠基因型的新方法应用

目的:建立融解曲线法和变性高效液相色谱(DHPLC)法准确、快速地鉴定苯丙酮尿症(PKU)模型小鼠的基因型.方法:融解曲线法采用聚合酶链反应(PCR)扩增包含模型小鼠pah基因点突变位点序列的132 bp片段,将该产物予Alw 26I酶切后,加入微量SYBR Green I,在实时PCR仪上行融解曲线分析,同时,酶切产物行12%聚丙烯酰胺凝胶电泳分析.DHPLC法是直接将132 bp片段扩增产物采用在部分变性条件下(60.9℃)行DHPLC分析,根据不同图谱作出基因型诊断.结果:融解曲线分析表明,野生型小鼠的DNA片段在84℃和81℃出现2个融解峰,突变纯合型小鼠DNA片段在76.5～77.5℃和81℃出现2个融解峰,杂合型小鼠DNA片段则在84℃、81℃和76.5～77.5℃均出现融解峰,3种峰型明显可被区分.DHPLC优化了佳分离效果的柱温,在优化的佳条件下,DHPLC图谱显示杂合型小鼠DNA具有显著特色的峰型,即除同源双链峰外,出现一个异源双链峰.上述2种新方法共检测了PKU模型小鼠突变纯合型20只、杂合型22只,野生型11只,2种方法检测结果一致,并且与经典的聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)法结果一致(动物毛色等表型也完全一致).结论:融解曲线法和DHPLC法均能准确、快速地鉴定模型小鼠的基因型,具有自动化、高通量等优点.

胃癌组织中Nupr1的表达及其临床意义

背景:胃癌的发病率和死亡率在全球居高不下,因此亟需探索胃癌诊断和治疗的新靶点.核蛋白1(Nupr1)具有多种生物学功能,尤其是在恶性肿瘤发生、进展过程中的作用突出.目的:探讨Nupr1在胃癌中的表达情况及其临床意义.方法:利用实时荧光定量PCR检测72例胃癌组织及其配对癌旁组织中的Nupr1 mRNA表达,以蛋白质印迹法和免疫组化技术检测Nupr1蛋白表达及其细胞定位,分析Nupr1表达与胃癌临床病理特征的关系.结果:胃癌组织中Nupr1 mRNA和蛋白表达均显著高于癌旁组织(P<0.05),两者表达变化趋势相一致.Nupr1蛋白主要表达于细胞质,细胞核内也可见少量表达.胃癌组织中的Nupr1 mRNA表达与肿瘤体积、分化程度、病理类型、Bormann分型、浸润深度、淋巴结转移、远处转移和TNM分期显著相关(P<0.05),与患者性别、年龄、肿瘤部位无明显相关性(P>0.05).结论:Nupr1在胃癌组织中高表达并可能与肿瘤侵袭、转移、进展相关,可作为胃癌早期诊断和预后评估的新标记物,并可能成为胃癌治疗的潜在靶点.

荚膜相关蛋白10与DEAD-box的RNA解旋酶基因联合检测诊断新生隐球菌性脑膜炎

目的 建立定量检测新生隐球菌荚膜相关蛋白10(CAP10)和DEAD-box的RNA解旋酶(VAD1)基因的方法,比较两者单独及联合应用诊断新生隐球菌感染的价值.方法 选择行脑脊液真菌培养、墨汁染色或隐球菌抗原检测,其中一项阳性的新生隐球菌性脑膜炎患者23例,以同期颅脑外伤患者为对照.以新生隐球菌标准株构建质粒标准品,建立实时荧光定量PCR(RT-FQ-PCR)体系,检测脑脊液中的CAP10和VAD1,并与墨汁染色、真菌培养、隐球菌抗原检测比较.卡方检验评价两者单独或联合应用的诊断价值.结果 在23例隐球菌性脑膜炎患者中,RT- FQ-PCR法检测CAP10 mRNA阳性22例,阳性率为95.6％,墨汁染色法阳性16例,阳性率为69.6％(x2=4.167,P＜0.05),真菌培养阳性15例,阳性率为65.2％(x2=5.143,P＜0.05),抗原检测法阳性21例,阳性率为91.3％(x2=0.500,P＞0.05).联合检测CAP10及VAD1基因诊断新生隐球菌性脑膜炎与单独检测CAP10或VAD1比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 成功建立以新生隐球菌毒力基因为靶标的RT-FQ- PCR检测方法,检测结果优于传统方法.

造血干细胞移植后对人巨细胞病毒感染病毒载量的检测

目的 探讨应用实时定量聚合酶链反应(RQ-PCR)法对异基因造血干细胞移植(alloHSCT)后巨细胞病毒(CMV)感染的诊断价值及对临床用药的指导意义.方法 33例行allo-HSCT的患者于造血重建后,应用RQ-PCR法对其外周血CMV DNA进行动态检测,根据检测结果决定抗CMV治疗的开始、减量和终止,观察治疗效果和临床转归.结果 共检出13例CMV感染患者,21次感染发作;除1次是患者中途放弃治疗外,余20次治疗中CMV DNA拷贝迅速转阴或下降至转阴,有临床表现者症状消失、器官功能恢复;且抗CMV疗程短于常规疗程.结论 应用RQ-PCR法不但可以早期诊断CMV感染,及时干预治疗,还可以直观指导治疗的减量和终止、缩短疗程、减轻药物不良反应.