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荧光原位杂交技术在实体瘤诊断中的应用
作为一种新型的细胞分子遗传学技术, 荧光原位杂交(FISH)是利用荧光标记DNA探针来检测细胞内染色体异常的非放射性原位杂交技术,可检测基因缺失、扩增、异位等异常,并结合组织形态学,提高病理诊断的准确性.文中主要综述其在实体瘤诊断方面的一些应用.
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应用2013年ASCO/CAP指南对Her-2IHC2+乳腺癌患者进行Her-2FISH分类
[目的]探讨2013年ASCO/CAP指南对IHC2+乳腺癌患者Her-2FISH分类的影响.[方法]采用荧光原位杂交法检测173例Her-2免疫组化2+的乳腺癌患者的Her-2基因的状态并应用2013年ASCO/CAP指南的标准对检测结果进行分析.[结果]与2007年检测指南相比,使用2013年检测指南使36例患者发生了变化,取得了较高的阳性率(28.3％vs.23.1％)和不确定率(16.2％ vs.4.0％),阴性比例下降(55.5％ vs.72.8％).[结论]2013年指南的使用提高了阳性率和不确定患者的比例,从而提高了Her-2靶向治疗的病例数.FISH对于IHC2+的患者能够起到后分类的作用,而17号染色体多体在FISH不确定的患者中占很大的比例.
关键词： HER-2 FISH IHC2+ ASCO/CAP指南 -
荧光原位杂交用于快速产前诊断
细胞遗传学分析是目前产前诊断的标准方法 [1],通常首选中期羊膜腔穿刺羊水细胞培养.但该诊断的取材时间受限,培养时间长(7～10d),效率低,技术较难掌握[2].近年来建立的荧光原位杂交(Fluorescent in situ hybridization,FISH)技术,其应用于未培养的羊水间期细胞,大大提高了诊断效率,只需48h即可给出诊断结果 ,现将笔者初步经验介绍如下.
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先天性中胚层肾瘤临床病理和分子遗传学分析
目的 探讨先天性中胚层肾瘤(congenital mesoblastic nephroma,CMN)的临床病理特征和分子遗传学改变.方法 回顾性分析9例CMN,总结其组织病理形态、免疫组化标记及ETV6基因易位FISH检测结果.结果 9例CMN均为2岁以内的患儿,其中8例小于1岁.肿瘤平均直径9.5 cm(3.2～ 15.0 cm).经典型3例,细胞型5例,混合型1例;其中5例可见囊性变,2例可见软骨岛.与经典型相比,细胞型CMN的肿瘤直径常更大,易出现出血、坏死,核分裂象更多见.免疫表型:肿瘤细胞表达vimentin,余未见特异性阳性标记,且均不表达WT-1.其中5例(4例细胞型和1例混合型)行ETV6基因易位FISH检测,3例细胞型CMN检出ETV6基因易位,1例细胞型和1例混合型CMN未检出ETV6基因易位.2例失访,7例随访5～ 46个月,均未见复发.结论 CMN为少见的婴幼儿肾脏肿瘤,具有独特的临床病理学特征,细胞型CMN有特异的ETV6基因易位.CMN多预后良好,需与其它儿童肾恶性肿瘤鉴别.
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胃癌组织中HER-2基因扩增和K-ras基因突变的关系
目的 探讨胃癌组织中HER-2蛋白表达和基因扩增与K-ras基因突变的关系及其意义.方法 采用免疫组化、FISH和焦磷酸测序技术对67例胃癌组织中HER-2蛋白表达、HER-2基因扩增与K-ras基因的突变率进行了检测.结果 HER-2蛋白阳性率为40.3％(27/67),其中HER-2蛋白3+者9.0％(6/67),HER-2蛋白2+者13.4％(9/67),HER-2蛋白1+者17.9％ (12/67).FISH检测HER-2基因扩增率为18.5％ (5/27),HER-2基因拷贝数增加和基因扩增者共48.1％ (13/27).K-ras基因突变定量检测为7.5％ (5/67),均为K-ras基因第12密码子突变,其中低于10％低丰度突变2例,高于10％高丰度突变3例(突变数值分别为:17、29、30).除1例为GGT→GAT突变型外,其它均为GGT→GTT突变型.本组K-ras基因突变5例中除1例既有K-ras基因突变,又有HER-2基因扩增,另外4例HER-2基因均无扩增.结论 检测胃癌中HER-2扩增时选用抗肿瘤药物治疗的靶点曲妥珠单抗,同时可选用K-ras基因突变的抗肿瘤药物治疗的靶点西妥昔单抗;联合检测胃癌组织中HER-2基因扩增和K-ras基因突变为靶向抗肿瘤药物治疗过程中受益提供参考指标.
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胃癌中MET基因扩增与蛋白表达的关联性分析
目的 探讨胃癌细胞中MET基因扩增与蛋白表达的相关性及其与临床病理特征的关系.方法 应用荧光原位杂交(fluorescent in situ hybridization,FISH)及免疫组化MaxVision法同时检测85例胃癌石蜡包埋组织中MET基因扩增及蛋白表达.结果 FISH检测胃癌细胞中MET基因扩增率为5％ (4/85);MET基因蛋白阳性率为43％ (37/85);MET基因扩增与蛋白表达检出率不同,结果具有统计学意义(P ＜0.005),故两者关联性低.结论 MET基因扩增与蛋白表达不一致,原因有待进一步分析.
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非小细胞肺癌EGFR基因突变与扩增及蛋白表达的相关性分析
目的：观察非小细胞肺癌（ non-sma11 ce111ung cancer，NSCLC）发生、发展中表皮生长因子受体（ epiderma1 growth factor re-ceptor，EGFR）基因突变及扩增与蛋白表达的相关性；探讨EGFR基因突变及扩增与NSCLC临床病理特征的关系。方法应用实时荧光定量PCR（ quantitative rea1-time po1ymerase chain reaction，qRT-PCR）、荧光原位杂交（ f1uorescent in situ hybridization， FISH）及免疫组化（immunohistochemistry，IHC）技术同时对NSCLC石蜡包埋组织中EGFR基因（18~21号外显子）突变、扩增及蛋白表达进行检测。结果 qRT-PCR技术检测NSCLC组织中EGFR基因（18~21号外显子）的突变率为58.18%（32/55），其中19号外显子缺失和21号外显子L858R点突变占87.50%（28/32）；EGFR基因突变与患者性别、吸烟史、组织病理分型有关（P<0.01），与患者年龄、淋巴结转移及TNM分期无关（P>0.05）；EGFR基因扩增率为23.64%（13/55），EGFR蛋白阳性率为70.91%（39/55）；EGFR基因突变与基因扩增具有一定相关性（ P<0.05），EGFR这两种基因状态与其蛋白表达无相关性（P>0.05）。结论 NSCLC EGFR基因突变在女性、无吸烟史及腺癌中表达较高，是酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibi-tors，TKI）筛查主要对象；EGFR基因突变与基因扩增具有一定相关性，但基因突变与扩增的先后顺序尚不清楚，需增加病例数进一步探讨；EGFR基因突变和扩增与蛋白表达不一致，原因有待进一步分析。
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大鼠肝脏发育成熟及癌变时miR-100的表达
目的：探讨microRNA-100(miR-100)在大鼠肝脏发育成熟和癌变时的表达。方法取新生SD乳鼠、成年SD大鼠肝组织以及经连续喂饲2-乙酰氨基芴加部分肝切除术(2-AAF/PH)诱导的SD大鼠肝癌组织,分别采用实时荧光定量PCR及FISH技术检测miR-100的表达。结果同新生SD乳鼠相比,miR-100在成年SD大鼠肝组织中表达明显升高( P<0．05)。大鼠肝脏癌变组织的miR-100表达较成年大鼠肝组织明显下降( P<0．05),接近于新生SD乳鼠miR-100的表达水平。结论 miR-100可作为SD大鼠肝脏发育成熟的标志,其表达降低可能与肿瘤形成有关。
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免疫组化染色及FISH法检测肺鳞状细胞癌中ALK蛋白的表达
目的：探讨棘皮类微管蛋白4(echinoderm microtubule-associated protein-like 4, EML4)与间变性淋巴瘤激酶基因(ana-plastic lymphoma kinase, ALK)融合在肺鳞状细胞癌中的发生率,为进一步开展靶向治疗提供参考。方法采用高度特异性和敏感性的ALK抗体(D5F3)对219例肺鳞状细胞癌石蜡包埋组织标本进行免疫组化染色,并对阳性标本行EML4-ALK荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization, FISH)检测。结果免疫组化染色检出ALK强阳性标本4例(1．8%,4/219)、中等强度3例和弱阳性6例。 FISH检测确认ALK强阳性标本存在EML4-ALK基因融合,中等和弱阳性标本为假阳性。结论肺鳞状细胞癌中存在少量EML4-ALK基因融合,其是否对Crizotinib治疗敏感亟需进行临床研究；免疫组化检测ALK蛋白强阳性才能判断为EML4-ALK基因融合。
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水泡状胎块与胎儿共存妊娠4例临床病理分析
目的 探讨水泡状胎块与胎儿共存妊娠的临床病理学特征.方法 收集4例水泡状胎块与胎儿共存病例,总结其临床病史及病理学特征,并进行p57免疫组化标记和荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)及核型分析.结果4例中3例为完全性水泡状胎块与胎儿共存的双胎妊娠,其中1例妊娠14周,胎儿宫内尚存活,利凡诺引产,2例妊娠29周,胎儿均存活,行剖宫产术取出,此3例均伴侵袭性葡萄胎合并肺转移;另1例为部分性水泡状胎块伴单胎妊娠,胎儿宫内死亡.3例完全性水泡状胎块绒毛滋养叶细胞p57均阴性,与之相连的正常胎盘中p57阳性;其中2例行绒毛FISH检测及核型分析,均为46XX.1例部分性水泡状胎块p57阳性.结论 完全性水泡状胎块可合并正常妊娠,胎儿可存活;部分性水泡状胎块常合并畸形胎儿或胎儿宫内死亡.与胎儿共存的完全性水泡状胎块发展速度,引起临床症状的时间因人而异,可发生于妊娠早期,也可为中晚期,发生于中晚期者胎儿常能存活分娩;伴正常妊娠的完全性水泡状胎块容易合并侵袭性葡萄胎且发生肺等远隔器官转移;完全性水泡状胎块与胎儿共存妊娠与患者孕前服用激素类药物有关.
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乳腺癌中PIK3CA基因突变与HER2表达及其基因扩增的关系
目的 探讨乳腺癌中PIK3CA基因突变与HER2蛋白表达和基因扩增之间的关系.方法 收集134例乳腺癌组织,采用免疫组化EnVision两步法检测HER2蛋白表达,采用FISH法检测HER2基因扩增,运用突变富集液相芯片法检测PIK3CA基因第9、20号外显子的突变状况,分析PIK3CA基因突变与HER2蛋白表达和基因扩增之间的关系.结果 134例乳腺癌组织中,49例检测到PIK3CA基因突变,突变率为36.6%,其中第9号外显子突变者16例(32.7%),20号外显子突变者33例(67.3%),50例(37.3%)检测有HER2基因扩增.在50例HER2基因扩增的病例中12例有PIK3CA基因突变(24.0%),84例无HER2基因扩增的病例中37例有PIK3CA基因突变(44.0%).有HER2基因扩增的乳腺癌PIK3CA基因突变率较无HER2基因扩增的乳腺癌低,差异具有统计学意义(χ2=5.431,P=0.020).PIK3CA基因突变与HER2蛋白表达的关系受HER2阳性定义标准的影响,不具有确定性.分别按乳腺癌HER2检测指南(2006版)、乳腺癌HER2检测指南(2009版)及2012年WHO乳腺肿瘤分类标准对入组病例进行分组分析,其中按2006版标准,PIK3CA基因突变率在HER2蛋白表达组间无差异(χ2=2.751,P=0.253);按2009版标准,PIK3CA基因突变率在HER2蛋白表达3+与非3+组间有差异(χ2=5.478,P=0.019);按2012版标准,PIK3CA基因突变率在HER2阳性与阴性组间有差异(χ2=4.286,P=0.038).结论 PIK3CA基因突变率在FISH检测的HER2基因扩增阳性与阴性之间有差异,HER2基因扩增的乳腺癌PIK3CA基因突变率低,与HER2蛋白表达的关系与阳性判断标准有关.
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乳腺浸润性导管癌中干细胞关键转录因子FoxD3的表达
目的 探讨干细胞关键转录因子FoxD3在乳腺浸润性导管癌(invasive duct carcinomas,IDC)组织中的表达.方法 采用免疫组化MaxVision法检测FoxD3、HER-2、Ki-67、ER和PR在79例乳腺IDC组织中的表达,HER-2结果附加荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)确诊.结果 FoxD3蛋白表达与患者年龄、病理分级、临床分期、HER-2状态和激素状态无明显相关(P>0.05).与淋巴结未转移组相比,淋巴结转移组低表达FoxD3蛋白(P<0.05),HER-2和Ki-67表达明显增高.与三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)相比,其他型乳腺癌FoxD3表达明显增加.FoxD3蛋白与Ki-67增殖指数无明显相关性.结论 FoxD3低表达可能促进乳腺癌淋巴结转移,有可能成为治疗乳腺癌的重要靶点之一.
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儿童盆腔黏液型滑膜肉瘤1例
患者女童,11岁,3天前无明显诱因出现下腹部疼痛,行走及夜间疼痛为重.腹部检查:全腹膨隆,左下腹饱满,触之有轻压痛、无反跳痛,有台阶样感,深部触诊不详.CT示盆腔内可见巨大软组织密度肿块,大横截面181mm×120mm,周围组织受压推移、分界不清.
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具有透明细胞形态的浆细胞骨髓瘤1例并文献复习
目的 探讨具有透明细胞形态的浆细胞骨髓瘤(plasma cell myeloma,PCM)的临床病理特征、诊断及鉴别诊断.方法 对1例具有透明细胞形态的PCM进行临床病理分析,行免疫组化EnVision法染色、FISH检测、染色体核型分析,并复习相关文献.结果 低倍镜下骨髓正常造血组织明显减少,代之以弥漫增生的肿瘤细胞.高倍镜下肿瘤细胞胞质丰富、淡染,细胞核小、圆形,核仁不明显,染色质细腻.免疫表型:肿瘤细胞CD38、CD138、VS38C、EMA及κ轻链均呈阳性.FISH检测结果示1q21基因扩增、RB1基因及D13S319基因单缺失.染色体核型分析结果为45,X,-Y(3)/46,XY(17).结论 具有透明细胞形态的PCM临床罕见,提高对病理形态学的认识有助于诊断及鉴别诊断.
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非特殊性浸润性乳腺癌 TOP2 A基因状态与分级、HER-2和 Ki-67的相关性
目的：探讨非特殊性浸润性乳腺癌中TOP2A基因状态与分级、HER-2和Ki-67的相关性。方法使用FISH法检测120例非特殊性浸润性乳腺癌中TOP2A基因状态，统计分析TOP2A基因状态与肿瘤分级、HER-2基因状态和Ki-67蛋白表达的关系。结果 TOP2A基因异常与非特殊性浸润性乳腺癌的分级、HER-2基因扩增以及Ki-67蛋白表达存在显著正相关关系，且TOP2A基因异常与HER-2基因扩增的相关性较其他二者密切。结论在非特殊性浸润性乳腺癌中分级高、Ki-67蛋白高表达且 HER-2基因扩增者， TOP2A基因异常发生率高，应用FISH法可快速准确检测其基因状态，帮助临床确立治疗方案，具有重大意义。
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208例内镜活检胃癌组织中HER-2蛋白的表达及意义
目的：分析内镜活检胃癌组织中HER-2蛋白的表达及意义。方法应用免疫组织化学( immunohistochemistry, IHC)法检测208例内镜活检胃癌组织中HER-2蛋白表达,采用荧光原位杂交( fluorescence in situ hybridization, FISH)技术检测IHC 2+胃镜活检组织中HER-2基因扩增,并对相应的临床病理特征(性别、年龄、肿瘤发生部位及Lauren分型)进行综合分析。结果208例内镜活检胃癌组织中HER-2 IHC 3+阳性率为7．7%(16/208),IHC 2+为13．5%(28/208),IHC 1+为45．7%(95/208),IHC 0为33．2%(69/208)。 IHC 2+的胃癌活检组织中 FISH 阳性率为14．2%(4/28)。 HER-2总体阳性率为9．6%；HER-2蛋白过表达与患者性别、年龄均无关( P>0．05),与发生部位及Lauren分型密切相关(P<0．05)。结论内镜活检胃癌组织中HER-2蛋白过表达与胃癌发生部位、Lauren分型密切相关。
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FISH和RT-PCR法在ALK基因检测中的临床应用分析
目的：探讨荧光原位杂交( fluorescence in situ hybrid-ization, FISH)和实时荧光定量逆转录聚合酶链反应( real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reac-tion, RT-PCR)技术检测非小细胞肺癌中间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase, ALK)突变的差异性。方法应用FISH及RT-PCR技术分别检测22例非小细胞肺癌中ALK基因突变,采用Spearman Correlation统计法进行差异性比较分析。结果两种方法在检测非小细胞肺癌中ALK基因突变的结果具有一致性( P<0.05)。结论虽然两种方法检测ALK基因突变结果具有一致性,但实际操作中RT-PCR法比FISH法更简便、敏感、易判读。
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血液疾病FISH检测中细胞交联的处理方法比较
荧光原位杂交（ f1uorescence in situ hybridization，FISH）技术是通过荧光标记的DNA探针与待测样本的DNA进行原位杂交，该技术具有快速、安全及灵敏度高等特点［1］。目前已广泛应用于细胞遗传学、基因扩增、血液疾病检测、产前诊断等领域。尤其在血液疾病中，对疾病的发病机制、诊断及预后提供重要的诊断依据。但由于该操作过程复杂，影响荧光信号的因素较多，因此，准确把握溶液的pH值、各步骤的温度及时间，及时发现洗涤液是否浑浊可避免出现信号弱或无信号等情况的发生［2］。标本的前期处理是 FISH检测血液疾病成功的关键，若标本处理不当，结果不易判读，其中细胞交联是影响判读的主要因素，本文就针对骨髓/血液细胞标本制片中出现的细胞交联进行改进。为骨髓/血液标本FISH检测提供佳的制片方法。
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ALK基因FISH检测失败的补救方法
随着分子病理学和个体化靶向治疗的发展， FISH技术作为分子诊断的主要工具，应用越来越广泛和普及。 FISH技术由于其具有检测ALK变异体类型的全面性，经FDA批准，用于临床非小细胞肺癌靶向用药人群的筛选。肺穿刺石蜡组织标本经过几轮切片(常规HE、免疫组化、EGFR突变检测)，所剩组织只能切出为数不多的适合FISH (切片可计数细胞>50个)实验的切片，如果FISH实验失败，几乎不可能重新切片；外院会诊的病例也存在无法重新获得白片的情况。因此，作者直接将FISH实验失败的片子重新处理，加探针，得到比较满意的结果，现介绍如下。
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介绍一种新型探针稀释液
随着分子生物学的不断发展,越来越多的分子生物学技术广泛运用于临床及基础医学的研究,荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)检测是分子诊断的重要工具.由于探针合成的成本较高,影响FISH技术在临床应用中的普及.本文推荐一种新型探针稀释液,效果良好,可降低其成本,现介绍如下.
