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铝对大鼠睾丸支持细胞雄激素结合蛋白mRNA表达的影响
目的:研究氯化铝对体外培养大鼠睾丸支持细胞的雄激素结合蛋白(ABP) mRNA表达的影响.方法:体外培养大鼠睾丸支持细胞为模型,分为对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组(0,300,400,500 μmol/L)氯化铝染毒睾丸支持细胞,培养24 h后采取MTT法检测细胞活性,RT-PCR法检测ABP mRNA的表达水平.结果:随着氯化铝染毒剂量的增大,ABP mRNA的表达下降.高剂量染毒组与对照组相比较,ABP mRNA的表达差异具有统计学意义(P＜0.05).结论:氯化铝对体外培养的睾丸支持细胞具有毒性作用,抑制ABP mRNA的表达,从而损伤支持细胞功能,导致生殖功能障碍.
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环境雌激素双酚A对男性生殖细胞影响的研究进展
近年来,世界各国男性不育的检出率呈逐年增高趋势.男性不育的原因复杂,包括先天性疾病和后天性因素如外伤、不良生活作息行为(吸烟、酗酒等)、环境污染、药物滥用等.近研究报道,发育早期暴露环境雌激素可干扰男性生殖系统发育和功能.双酚A(bisphenol A,BPA)是普遍存在的一种环境雌激素.动物实验和体外研究报道,发育早期暴露BPA可抑制人和小鼠胎儿期睾丸间质细胞分泌睾酮；BPA可通过影响雄性子代生精细胞内基因的正常表达,干扰减数分裂,影响精子的产生；BPA还可降低新生小鼠睾丸支持细胞间连接蛋白的表达；在激素水平上,BPA可抑制小鼠促性腺激素释放激素和卵泡刺激素的产生.本文就BPA通过影响睾丸间质细胞、生精细胞和支持细胞的功能,导致男性不育进行综述,对进一步研究男性不育的原因提供新思路.
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睾丸支持细胞(sertoli细胞)与器官移植
器官移植后免疫排斥反应是近年来研究的热点和难点,睾丸支持细胞具有天然的免疫豁免功能.本文分别从器官移植后免疫排斥反应的特点,睾丸支持细胞的免疫豁免机制及该细胞在器官移植中的应用现状等方面进行综述,以便寻求降低器官移植术后免疫排斥反应发生的新方法.
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人睾丸支持细胞的分离培养及鉴定
目的:建立人胚胎睾丸支持细胞体外分离,纯化及培养的方法,并进行鉴定.方法:取胎龄13～28周的胚胎睾丸,采用两步酶消化,添加特定培养基,培养过程中纯化睾丸支持细胞,并用免疫荧光及RT-PCR技术对培养细胞进行鉴定.结果:通过检测阶段特异性标记物MIS提示胚胎睾丸支持细胞占培养细胞总数的90%以上,经RT-PCR及免疫荧光检测所培养细胞具有分泌产生SCF的能力.结论:在本研究建立的培养体系下细胞可稳定传代,经鉴定为高纯度的睾丸支持细胞,并维持了其体内生物学活性.
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Rictor/mTORC2调节小鼠睾丸血睾屏障与精子发生
目的 研究Rictor/mTORC2在睾丸血睾屏障形成、睾丸发育和精子发生中的作用及相关机制.方法 采用Cre-loxP重组酶系统,构建睾丸支持细胞中rictor基因敲除小鼠.比较敲除鼠和对照鼠的生殖器官外观和质量.HE染色观察睾丸和附睾的组织形态.采用流式细胞技术检测生精小管的细胞周期.采用免疫荧光技术检测增殖蛋白(Ki-67)和分离酶蛋白的表达.采用免疫组化和Western blot技术检测血睾屏障相关蛋白表达.结果 相比对照鼠,敲除鼠的睾丸和附睾体积和重量都明显变小(P<0.01);敲除鼠的生精细胞中二倍体细胞显著上升(P<0.01),单倍体细胞显著下降(P<0.01),而四倍体细胞、Ki-67和分离酶蛋白无显著差异;血睾屏障相关蛋白出现严重的位置错乱,而蛋白表达量不受影响.结论 睾丸支持细胞中rictor基因的正常表达,在血睾屏障结构完整性维持和功能发挥以及精子正常发生中起着至关重要作用.
关键词： 血睾屏障 睾丸支持细胞 精子发生 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白 Rictor -
环磷酰胺及长春新碱对睾丸支持细胞间隙连接蛋白表达的影响
目的:探讨环磷酰胺、长春新碱对睾丸支持细胞间隙连接蛋白(Cx) 43表达的影响.方法:培养小鼠睾丸支持细胞,分别加入环磷酰胺(0、1、2、4、8 μg/mL)和长春新碱(0.00、0.01、0.02、0.04、0.08 μg/mL)行细胞毒染24 h,MTT法检查细胞毒性.选择4 μg/mL环磷酰胺、0.04 μg/mL长春新碱作用支持细胞6、12、24及48 h,结果行RT-PCR分析;选择同样浓度药物作用支持细胞24 h,并用免疫荧光染色检测培养的细胞中Cx43的表达情况.结果:环磷酰胺、长春新碱染毒细胞后,Cx43 mRNA水平开始随时间增加而逐渐下降(P＜0.05),且随剂量增加Cx43表达强度逐渐减弱(P＜0.05).结论:环磷酰胺及长春新碱对睾丸支持细胞有毒性,并随着药物浓度增大毒性增强,且环磷酰胺比长春新碱更明显.
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小鼠睾丸支持细胞的体外分离、培养与鉴定
目的:用改良方法对小鼠睾丸支持细胞进行体外快速分离与培养,以期建立一种简单快捷纯度高的支持细胞原代培养方法.方法:用0.25%胰蛋白酶和0.1%胶原酶,对睾丸组织进行次第消化,用福尔根染色法和免疫细胞化学方法鉴定睾丸支持细胞.结果:细胞培养72h存活率超过90%,纯度在85%以上.福尔根染色和免疫细胞化学染色结果示,分离细胞有卫星核小体存在,且细胞中FasL阳性表达,表明分离培养的细胞确为睾丸支持细胞.结论:睾丸组织经曲细精管分离后进行胶原酶和胰蛋白酶次第消化,可快速高效分离睾丸支持细胞.
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睾丸支持细胞与移植
1865年德国人Enricol首先描述了睾丸支持细胞(sertoli cell,SC)的结构.尽管发现SC的年代久远,但只是在电镜技术和细胞培养技术问世后,才对其功能有所认识.目前认为SC是生精细胞的支架,能合成与分泌雄激素结合蛋白,并为其提供高浓度的雄激素环境及必需的营养物质.新研究显示,SC还具有免疫豁免(immune privilege)功能,共同移植SC可延长同种异体移植物的存活时间.现就SC及其在移植领域的研究进展作一综述.
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睾丸支持细胞相关激素影响的研究进展
睾丸支持细胞(Sertoli cells,SCs)是构成睾丸的主要细胞成分,其附着在睾丸中曲精小管的基膜上,为精子的产生提供营养和结构支持.研究表明,多种激素调节SCs的生长、发育、增殖、分化及代谢等过程,包括雄激素、雌激素、卵泡刺激素及胰岛素等,各激素及其信号通路之间也存在相互作用和影响.多种原因引起的激素调节异常都可能引起精子参数的异常,进而导致男性不育症的发生.目前多种激素对SCs的具体作用机制尚未完全明确,探讨各激素对SCs的具体调控机制,明确它们之间的相互作用关系,对男性不育症的预防、诊治及预后具有重大意义.本文就SCs激素影响的研究进展作一综述.
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枸杞多糖对大鼠睾丸支持细胞体外增殖的影响
目的 观察枸杞多糖对体外培养的大鼠睾丸支持细胞的增殖作用.方法 选8～9 d龄的大鼠,采用两步酶消化法获取原代大鼠睾丸支持细胞,加入不同质量浓度的枸杞多糖,采用MTT比色法、直接细胞计数及CFSE荧光标记,检测不同质量浓度枸杞多糖对体外培养别的睾丸支持细胞增殖的影响.结果 与对照组相比,经枸杞多糖处理后的睾丸支持细胞数量明显增多,并呈剂量依赖性.结论 枸杞多糖能够促进大鼠睾丸支持细胞体外增殖.
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邻苯二甲酸二丁酯和苯并[a]芘联合染毒对大鼠睾丸支持细胞的影响
目的 探讨邻苯二甲酸二丁酯和苯并[a]芘单独或联合染毒对大鼠睾丸支持细胞增殖及乳酸分泌的影响.方法 分离纯化大鼠睾丸支持细胞,油红O染色鉴定纯度大于90%后,以0.1、1、10、100、500 μg/ml 邻苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate,DBP)和0.01、0.1、1、10、100 μg/ml 苯并[a]芘[benzo(a)pyrene,BaP]单独或依次联合染毒,用MTT法检测对支持细胞增殖的影响,并测定培养液中的乳酸含量.结果 DBP染毒后100 μg/ml 吸光度值[D(490)]显著高于对照组(P＜0.01).BaP染毒各组的D(490)值与对照组比较,无统计学差异.DBP 100 μg/ml+BaP 10 μg/ml联合染毒组D(490)值显著上升(P＜0.01),而在500 μg/ml DBP+50 μg/ml BaP联合染毒组D(490)值下降(P＜0.05).DBP 100 μg/ml组、 100 μg/ml DBP+10 μg/ml BaP组和500 μg/ml DBP+50 μg/ml DBP组培养液中的乳酸显著增加(P＜0.01),DBP 500 μg/ml组和BaP 50 μg/ml组培养液中的乳酸含量也增高(P＜0.05).结论 一定剂量DBP可刺激支持细胞增殖并增加乳酸分泌,BaP虽不抑制支持细胞的增殖,但可使乳酸分泌增加.二者联合作用,在一定剂量下以DBP的效应为主,但在高剂量可抑制细胞增殖,呈现一定的协同作用.
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茶多酚对铝致大鼠睾丸支持细胞损伤的拮抗作用研究
目的 探讨茶多酚(TP)对铝暴露大鼠睾丸支持细胞损伤的拮抗作用.方法 原代培养大鼠睾丸支持细胞.将细胞分为0 μmol/L AlCl3(对照组)、400 μmol/L AlCl3(铝暴露组)、40 μg/mL TP +400 μmol/L AlCl3组(低剂量拮抗组)、160μg/mL茶多酚+400 μmol/L AlCl3组(高剂量拮抗组),各组用相应的药物处理24 h.四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测各组细胞的生长活性;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测抑制素B(INHB) mRNA的表达.结果 与对照组比较,铝暴露组的细胞活性、IN-HB mRNA表达均明显下降,差异有统计学意义(P＜0.05).与铝暴露组比较,低剂量拮抗组、高剂量拮抗组能够明显提高细胞活性,差别具有统计学意义(P＜0.05).与铝暴露组比较,高剂量拮抗组能够明显提高INHB mRNA表达,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 高剂量TP能够拮抗铝对大鼠睾丸支持细胞的损伤.
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亚硝酸钠对大鼠睾丸支持细胞DNA损伤的研究
[目的]观察亚硝酸钠对大鼠睾丸支持细胞DNA的损伤作用.[方法]采用冷胰酶消化法分离培养大鼠睾丸支持细胞,采用单细胞凝胶电泳法检测亚硝酸钠对大鼠睾丸支持细胞DNA的损伤作用.试验共设6个剂量组,亚硝酸钠终浓度分别为1.5μg/ml、15μg/ml、150μg/ml和1500μg/ml,同时设PBS阴性对照组和丝裂霉素C阳性对照组(20μg/ml).[结果]当亚硝酸钠剂量为15μg/ml时,可引起支持细胞拖尾率的增加,与阴性对照组相比,其差异有统计学意义(x2=18.320, P=0.000),但共尾长、尾/头(长)、尾距等较为客观的距离指标与阴性对照组相比,则在亚硝酸钠剂量达150μg/ml时,差异才有统计学意义,随着染毒剂量的增加,DNA损伤程度明显加重,存在明显的剂量-效应关系.[结论]亚硝酸钠具有损伤睾丸支持细胞DNA的作用,并且在染毒剂量为150μg/ml时,能观察到明显的损伤效应.
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改良的大鼠睾丸支持细胞分离培养方法
目的简化睾丸支持细胞的分离方法,提高细胞产量.方法采用0.25%胰酶、0.05%胶原酶序贯两步消化法消化,细胞悬液在37°C、5%CO2培养箱内孵育培养48 h,观察产量和细胞功能.结果改良的分离方法所获得的睾丸支持细胞占细胞总数的90%以上,大大提高了支持细胞的获取量,细胞Fas配体(Fas-L)表达功能正常.结论改良的分离培养方法简化了传统的分离培养方法,同时提高了细胞产量.
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两步酶法在小鼠睾丸支持细胞分离与培养过程中的研究
目的:探讨两步酶法分离小鼠睾丸支持细胞以及在体外培养、 纯化、 鉴定过程中的优越性.方法:选取7～8d雄性昆明小鼠,用胶原酶Ⅳ及胰蛋白酶两步酶法分离小鼠睾丸组织获得支持细胞,利用细胞差速贴壁特性纯化支持细胞,利用倒置显微镜、PI染色、 特异性抗体标记的方法从多个维度鉴定小鼠睾丸支持细胞.结果:培养72 h后支持细胞呈片状平铺于培养皿底层,相互接触,连接成片.用波形蛋白特异性鉴定证实本实验分离所获得的小鼠睾丸支持细胞.经过PI染色提示这些支持细胞为具有活性的支持细胞.结论:本研究提示两部酶法是一种简便且高效的分离小鼠睾丸支持细胞的有效方法,值得推广.
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成人睾丸支持细胞的分离培养及其免疫豁免机制
目的: 建立成人睾丸支持细胞的体外培养方法并探讨其免疫豁免机制.方法: 依次用胰蛋白酶、胶原酶、透明质酸酶及脱氧核糖核酸酶消化制备成人睾丸支持细胞,以SABC染色法检测支持细胞上Fas-L和TGF-β1的表达.将其与成人脾细胞共同培养,用MTT比色法检测其对脾细胞增殖的抑制作用.结果: 成人睾丸支持细胞占培养细胞总数的80%以上,活性可达90%.睾丸支持细胞上可表达Fas-L和TGF-β1,外可抑制共培养的脾细胞增殖.结论:建立了培养成人睾丸支持细胞的方法,其免疫豁免机制可能与Fas-L和TGF-β1的表达有关.
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BrdU标记在大鼠睾丸支持细胞体外培养中的应用
目的:探讨大鼠睾丸支持细胞原代培养5-溴-2-脱氧尿苷(BrdU)的佳标记时间、剂量.方法:大鼠睾丸支持细胞进行体外原代培养;以终浓度分别为5、10、15、20 μmol/L的BrdU检测睾丸支持细胞的佳标记剂量;在细胞培养的12、24、36、48 h掺入BrdU,使终浓度为15 μmol/L,测定BrdU的佳标记时间;免疫细胞化学法跟踪观察大鼠睾丸支持细胞在体外培养中的分化发育情况和BrdU标记率.结果:免疫组化检查提示终浓度为15lμmol/L和孵育36 hBrdU标记率均>90%,并且连续传3代均可检测到.结论:终浓度15 μmoL/L及孵育36 h为BrdU标记睾丸支持细胞的佳剂量及时间,表明BrdU标记可用于睾丸支持细胞体内后的存活、生长的动态观察.
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睾丸支持细胞介导局部免疫耐受的进展
机体的某些特殊部位在植入异体组织后不会发生排斥反应,且这些移植组织可长期存活,如眼、睾丸、脑等特殊区域,这些区域称为免疫豁免区[1].免疫豁免区的组织若移植到其他部位,能抵抗排斥反应而存活,诱导局部产生免疫耐受.睾丸是天然的免疫豁免区,研究证实睾丸支持细胞(Sertolicells,SC)是维持其免疫豁免功能的主要细胞[1],共同移植SC可延长同、异体移植物的存活时间,因而,SC的免疫豁免特性倍受关注.现就SC共移植在同、异体移植方面的进展综述如下.
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邻苯二甲酸二丁酯和苯并[a]芘对大鼠睾丸支持细胞波形蛋白和微管蛋白表达的影响
背景与目的:探讨邻苯二甲酸二丁酯(di-n-butyl phthalate,DBP)和苯并[a]芘[benzo(a)pyrene,BaP]单独或联合染毒对大鼠睾丸支持细胞波形蛋白和α-微管蛋白表达的影响.材料与方法:分离纯化大鼠睾丸支持细胞,以1、10、100 μg/ml DBP和0.1、1、10 μg/ml BaP单独或依次联合染毒12、24、48 h后,用免疫荧光方法检测细胞中波形蛋白和a.微管蛋白的表达. 结果:与DMSO组比较,染毒24 h后,10 μg/ml DBP与1 μg/ml BaP均可诱导波形蛋白表达水平下降(P<0.05),100 μg/ml DBP组和10 μg/ml BaP组的波形蛋白下降更为显著(P<0.01),100 μg/ml DBP+10 μg/ml BaP联合染毒组波形蛋白的表达显著降低(P<0.01).染毒48 h后,DBP和BaP单独染毒中、高剂量组波形蛋白的表达显著降低(分别为P<0.05和P<0.01);联合染毒各组的波形蛋白表达与DMSO组相比均显著减少(P<0.05或P<0.01),但与DBP和BaP各对应剂量单独作用组并无显著差异(P>0.05).染毒24 h后,10 μg/mlBaP组α-微管蛋白表达明显增加(P<0.05);48 h后,100 μg/ml DBP组α-微管蛋白表达显著上升(P<0.05),BaP各组α-微管蛋白表达均显著增加.结论:一定剂量的DBP和/或BaP可诱导大鼠支持细胞内波形蛋白表达降低,微管蛋白表达增加,二者联合作用呈现拮抗效应.
