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三价铕-敌鼠荧光增敏体系研究及在尿液残留测定中的应用
目的 建立一种简便、准确、灵敏的尿液中敌鼠残留的荧光分光光度测定方法.方法 利用敌鼠与稀土元素三价铕离子在DL-组氨酸、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)及氨性缓冲溶液存在下形成敌鼠-铕-DL-组氨酸-NH3-PvP的多元络合荧光体系,并进一步经稀土元素三价钇离子增敏,采用330nm为激发波长,以612nm为发射波长进行荧光光度法测定.结果 荧光分析体系的佳试验条件为:氨性缓冲溶液pH为9.0,铕离子为10.0mg/L,钇离子为20.0mg/L,DL-组氨酸为0.01%,PVP为0.05%.在此条件下,尿液中敌鼠浓度在0.2～10.0mg/L范围内与体系的荧光强度成线性关系,其平均回收率在87.0%～97.3%范围,日内RSD在3.4%～4.7%范围,日间RSD在4.8%～6.6%范围,低定量检出限为0.2mg/L.结论 该方法简便,结果准确可靠,用于尿液样品的测定,可获得满意的结果,该方法能用于敌鼠中毒病人的临床快速检测.
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血清胰岛素TRFIA的建立
目的 建立血清胰岛素( Ins)时间分辨荧光免疫分析法(time-resolved fluoroimmunoassay,TRFIA).方法 采用一株Ins-MAb包被于固相微孔板上,另一株Ins-MAb用DTTA- Eu3+标记作为示踪剂采用Victor 1420荧光仪测定,.并对本法进行评价.结果 本法的标准曲线范围为5～ 160 mU/L.灵敏度为0.35mU/L.检测3个浓度的Ins样品,批内CV为0.90％ ～4.10％,批间CV为4.55％～4.96％.平均回收率为97.7％～102.9％.用本法与DSL酶免分析方法同时测定80份血清样品,相关系数为0.982.结论 本文建立的Ins-TRFIA具有特异性强、灵敏度高及操作简单等优点,适用于临床血清Ins的检测.
关键词： 胰岛素 铕 时间分辨荧光免疫分析 单克隆抗体 血清 -
TR-FIA与RIA法检测HBV标志物的比较分析
铕(Eu)标记时间分辨荧光免疫技术(TR-FIA)是新近推出的一种非放射性标记微量检测技术, 将其与RIA比较分析, 结果表明: TR-FIA法较RIA法灵敏度高, 测量范围宽, 准确度相近; 在乙型肝炎病毒标志物(HBV M)常见的8种组合模式中, 有7种完全符合(符合率为100%),只有HBSAg+抗-Hbe+抗-HBc组合模式符合率为73.3%,而HBeAg值差异较大.
关键词： 铕 时间分辨荧光免疫分析 放射免疫分析 肝炎病毒 乙型 -
铕标记基因探针半定量检测丙型肝炎病毒RNA
目的利用自行设计的引物、探针和新型铕螯合物BHHCT,建立一种半定量丙型肝炎病毒(HCV) RNA的检测方法.方法收集44份丙型肝炎病人血清,20份正常人血清.利用中山大学达安基因有限公司RNA提取试剂提取HCV RNA,用自行设计的引物进行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR).扩增产物cDNA与微孔板上的捕捉探针杂交后,借助于其上游引物5′端带有的生物素,与标记有铕的链霉亲合素特异性结合,将铕连接到微孔板上,在特定波长激发光激发下,发出荧光,进行检测.结果铕标记HCV RNA检测法的线性范围为102～106 cDNA拷贝,敏感性、特异性均为100%.结论铕标记RT-PCR检测HCV RNA法的线性范围宽,敏感性、特异性好,检测时间短,无放射性污染,有推广应用的价值.
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稀土铕荧光探针在检测阿魏酸哌嗪片中阿魏酸含量的研究与应用
目的 建立稀土荧光探针法测定阿魏酸哌嗪片中阿魏酸含量的方法.方法在336 nm和545 nm为激发波长和发射波长条件下,应用阿魏酸-荧光体系测定了阿魏酸的含量,与标准方法测得的结果进行对比.结果该方法线性关系良好,线性方程为:If=40.171C+15.566,相关系数r=0.994,结果比较满意.结论该方法简便、快速、灵敏,可作为制剂的含量直接分析方法.
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时间分辨荧光免疫分析技术及临床应用
标记免疫分析技术的出现使临床生化分析由常量分析向微量分析转变.20世纪80年代出现的时间分辨荧光免疫分析技术,以其独特的优势成为有发展前途的非放射免疫标记技术.本文主要介绍时间分辨荧光免疫技术基本原理、基础试剂、基本技术以及近年来临床应用.
关键词： 时间分辨荧光免疫分析技术 铕 标记技术 -
基于纳米铕核铁蛋白时间分辨荧光免疫方法的建立
以人铁蛋白(ferritin,FER)为材料,制备纳米铕核微粒,并建立竞争型FER免疫检测方法.用稀盐酸解离FER的亚基后,纯化脱去游离铁,再通过酸碱中和方法重组蛋白外壳,同时将铕离子包裹于去铁蛋白内,制备铕核铁蛋白.经反应条件优化,确定pH 2.0为FER适解离酸度.FER外壳重组时,铕试剂的添加量约为FER物质量的10 000倍时能获得大捕获效率.以此建立了铕核-FER时间分辨荧光免疫检测方法,其灵敏度为0.576 ng/mL,IC50为13.15 ng/mL,批间变异系数cv％＜15％,非特异性结合率低.用制备成的铕核-FER构建的竞争法TRFIA与FER夹心法试剂盒对照,两者相关系数达0.966.通过上述方法获得免疫活性好、铕含量高的标记用纳米分子,简化了传统的铕标记方法,建立了构建纳米铕核铁蛋白的新方法.
关键词： 铁蛋白 铕 生物纳米材料 时间分辨荧光免疫分析 体外分析 -
检测游离β-HCG时间分辨免疫荧光分析法的建立及临床应用
目的 建立一种快速灵敏的时间分辨免疫荧光分析法(TRFIA),用于定量检测孕妇血清中游离β人绒毛膜促性腺激素(β-HCG)的浓度.方法 包被游离β-HCG单克隆抗体,铕(Eu~(3+))标记抗β-HCG单克隆抗体,建立双抗体夹心法游离β-HCG TRFIA,对该试剂的各项指标进行评价.结果 低检测量＜0.06 ng/mL;线性检测范围为0.052～400 ng/mL;分析内和分析间变异系数分别为1.0%～6.4%、3.3%～5.1%;人黄体生成素(HLH)、人促甲状腺素(HTSH)、人促卵泡激素(HFSH)和人绒毛膜促性腺激素(HCG)与本试剂的交叉反应率分别为0.04%、0.03%、0.05%和0.11%;1 043份孕妇血样用该试剂与进口同类试剂同时检测,2种试剂检测值具有显著相关性(r=0.990,P=0.000);血清样本2～8 ℃储存超过3 d,室温储存1 d或冻融2次,与新鲜样本比较,游离β-HCG浓度显著性增加(P＜0.05).结论 该试剂敏感性高、特异性强、操作简便快捷,具有良好的精密度,可以替代进口试剂用于临床样本的检测.为保证结果 的可靠性,应注意样本的保存条件.
关键词： 游离β人绒毛膜促性腺激素 时间分辨免疫荧光分析法 铕 产前筛查 -
甲磺酸培氟沙星胶囊及其在人尿液中含量的铕敏化荧光法测定
在pH 5.9醋酸盐缓冲溶液中,甲磺酸培氟沙星和铕(Eu3+)、EDTA易形成2:1:1的三元配合物,产生Eu3+的特征荧光.由此建立了铕敏化荧光法测定甲磺酸培氟沙星胶囊及其在人尿液中的含量.
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稀土元素铕标记技术的应用研究
时间分辨荧光免疫分析法(time-resolved fluoroimmunoassay,TRFIA)是20世纪70年代末即已建立的一种荧光免疫分析技术[1].1983年,Pettersson等和Eskola等先后报告用此法测定人绒毛膜促性腺激素和胰磷酯酶A2[2].迄今,TRFIA已成为有发展前途的非同位素标记免疫技术之一[3],该技术的关键是稀土元素的标记.本文仅就稀土元素原子结构特点、标记技术以及TRFIA技术做简要介绍.
关键词： 稀土元素 铕 标记 时间分辨荧光免疫分析 -
丙型肝炎抗体Eu3+、Sm3+双标记分析法的建立及应用
目的 建立能同时检测抗HCV-免疫球蛋白(Ig)M和抗HCV-IgG抗体的时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)法.方法 采用HCV重组抗原包被,制备Eu3+标记抗人IgM和Sm3+标记抗人IgG抗体;采用间接法建立HCV-IgM和HCV-IgG TRFIA并行优化和方法学考核.用百分位数法单侧95％计算阳性判定(CO)值.结果 以1个样本检测值/阳性判定值(S/CO)为单位,HCV-IgM和HCV-IgG的检测灵敏度分别为0.06和0.15 S/CO.分别将HCV-IgM和HCV-IgG强阳性的标本从1:12.5倍比稀释到1:51200,HCV-IgM在1:12.5～1:12800呈较好线性反应,HCV-IgG在1:25～1:6400呈较好线性反应.HCV-IgM和HCV-IgG的平均批内CV分别为3.37％和3.66％,平均批间CV分别为6.52％和6.75％.用酶联免疫吸附测定法作为参照,检测HCV阳性标本和阴性标本各20例,两者HCV-IgM阳性符合率为100.0％(20/20),阴性符合率为90.0％(18/20),总符合率为95.0％(38/40);HCV-IgG相应数据分别为100.0％(20/20)、95.0％(19/20)和97.5％(39/40).试剂盒于37℃ 放置7 d检测,荧光计数值分别下降11.1％和9.5％,稳定性能良好.结论 建立的HCV-IgM和HCV-IgG TRFIA双标记分析法1次测量可同时得到HCV-IgM和HCV-IgG结果,是一种宽量程、高特异性、高灵敏度、稳定性好的方法.
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双标记时间分辨荧光免疫分析检测AFP和AFP-IgM在HCC中的应用
目的 建立可同时测定血清甲胎蛋白(AFP)和AFP免疫复合物(AFP-IgM)的快速、灵敏检测方法,探讨其在原发性肝细胞癌(HCC)诊断中的临床价值.方法 利用时间分辨免疫荧光分析(TRFIA)技术,分别用Sm3+标记鼠抗人IgM单克隆抗体(M94181),Eu3+标记鼠抗人AFP单克隆抗体(M19301),建立双标记TRFIA(dual-TRFIA).选择HCC患者118例和肝良性病变(BLD)患者123例(肝硬化60例,慢性肝炎63例),健康体格检查者286例.分别用该法检测血清AFP和AFP-IgM水平,并用受试者工作特征(ROC)曲线进行临床诊断特性分析.采用SASS 6.12软件进行统计学处理.结果 dual-TRFIA法检测AFP和AFP-IgM的灵敏度分别为0.41 ug/L,10.00 U/L,与试剂盒[电化学发光免疫(ECLIA)AFP test和Hepa AFP-IC kit]相关性好(r=0.9987和0.9854,P均<0.05).AFP和AFP-IgM在HCC中的诊断灵敏度分别为46.61%(55/118),63.56%(75/118),诊断准确性分别为77.10%和77.40%.AFP和AFP-IgM联合检测可将灵敏度提高至72.88%(86/118,x2= 9.45,P=0.02),诊断准确性提高至84.10%(x2=6.24,P=0.04).结论 AFP-IgM是HCC新型血清标志物,同时检测AFP和AFP-IgM能明显提高对HCC的诊断灵敏度和准确性,有利于肝癌的早期诊断.dual-TR-IMFA法同时检测AFP和AFP-IgM稳定可靠,可以满足临床使用需要.
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孕母血清游离β绒毛膜促性腺激素时间分辨荧光免疫试剂盒的研制与评价
目的 研制一种用于产前筛查孕母血清游离β绒毛膜促性腺激素(free hCG β)的时间分辨荧光免疫(TRFIA)试剂盒.方法 采用2株free hCG β单克隆抗体(McAb),一株用于固相包被(3 μg/ml),另一株用于标记铕(Eu~(3+))制备Eu~(3+)-free hCG β McAb,以β-萘甲酰三氟丙酮为主要成分的增强液,应用双抗体夹心法建立free hCG β TRFIA法,并对其进行性能评价.采用线性回归分析及配对t检验进行统计学分析.结果 该试剂盒的剂量-反应曲线线性相关系数(r)达0.9990;分析内、分析间变异系数(CV)均小于10.00%;标准品各点实测值与标示值的偏差(DIFF)均小于5.00%;灵敏度不高于0.20 μg/ml;以国家标准品为对照,标准品效价比在0.900～1.100间;与人促甲状腺激素(hTSH)、人黄体生成素(hLH)、人卵泡刺激素(hFSH)和人绒毛膜促性腺激素(hCG)交叉反应低;线性范围为2.00～200 ng/ml;与同类国外试剂比对,线性回归方程为Y=x+0.0565,r=0.9771,检测结果间差异无统计学意义(t=0.1839,P>0.05);国内外同类仪器比对检测,线性回归方程为y=0.9894x+0.0957,r=0.9995,检测结果间差异无统计学意义(t=-0.9669,P>0.05);室间质量评价实测值与靶值偏倚(-11.93%～7.01%)符合标准;干扰实验表明乙二胺四乙酸钾(EDTA-K_2)>0.54 mmol/L、柠檬酸钠≥1.06 mmol/L、草酸钾(K_2C_2O_4H_2O)≥2.12 mmol/L、氟化钠(NaF)≥29.76 mmoL/L时,自制试剂盒检测结果明显偏低(干扰程度均>10%),肝素≤150 U/L、血红蛋白≤12 g/L、三酰甘油≤21.54 mmol/L和胆红素≤818 μmol/L对该试剂盒检测结果无明显干扰(干扰程度均<10%);温度升高会使样本检测结果偏高.结论 该试剂盒具有灵敏度高、特异性强、准确度好、线性范围宽等优点,与国外的同类产品性能相仿,能满足临床需要.
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时间分辨荧光免疫分析法检测C反应蛋白方法的建立及应用
目的 制备4,7-(氯磺酸基苯基)-1,10-菲啰啉-2,9-二羧酸(BCPDA)鳌合剂,并以其建立时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)技术检测C反应蛋白(CRP)的方法.方法 用二甲基甲酰胺(DMF)溶解自制BCPDA后测定其吸光度;以BCPDA分别标记铕(Eu3+)、CRP多克隆抗体制备CRP多克隆抗体-BCPDA-Eu3+荧光标记物;以纳米磁珠为固相载体包被CRP单克隆抗体,分别加入CRP抗原及CRP多克隆抗体-BCPDA-Eu3+,应用六合一板式检测仪检测CRP荧光强度.结果 自制BCPDA吸收光谱为220～360 nm, 用337 nm 的紫外光激发得到CRP多克隆抗体-BCPDA-Eu3+的荧光发射光谱, 利用TRFIA可检测到0.1 mg/L 的CRP抗原.结论 本研究成功制备CRP多克隆抗体-BCPDA-Eu3+荧光标记物并建立了TRFIA检测CRP的方法,此为临床检测CRP提供了新的思路,亦为TRFIA的推广应用提供了理论依据.
关键词： 时间分辨荧光免疫分析法 铕 C反应蛋白 -
荧光光度法测定血清中卵磷脂的含量
目的:建立测定卵磷脂(PC)含量的荧光光度法.方法:以多西环素(DC)-铕(Eu3+)为荧光探针,在pH7.1条件下,扫描不同浓度的PC与DC-Eu3+的荧光光谱,优化测定PC含量的佳试验条件.结果:主要试验条件佳值为DC浓度3.0×10-6mol·L-1,Eu3+浓度1.0×10-5mol·L-1,PC检测浓度线性范围为4.0×10-7～2.4×10-5mol·L-1,检测限为3.1×10-7mol·L-.结论:该方法能成功地应用于实际样品的含量测定.
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新型掺铕多孔磷灰石/硅灰石磁性生物活性玻璃陶瓷的研究
通过溶胶-凝胶工艺制备了一种掺铕磷灰石/硅灰石多孔磁性生物活性玻璃陶瓷材料.采用DTA、XRD、SEM、能谱(Energy dispersive spectroscopy,EDS)、诱导耦合等离子体原子发射光谱(Inductive couple plasma atomic emission spectrometry,ICP-AES)、振动磁强计(Vibrating sample magnetometer,VSM)等方法分析材料的制备工艺、晶相组成、显微结构、磁性、生物活性和降解性.结果表明:材料的主晶相除了包括氟氧磷灰石、β-硅灰石相外,掺入的稀土元素Eu进入硅酸钙晶核内部形成Ca2Eu8(SiO4)6O2 物相.当Eu2O3的掺入量为2%(质量百分比)时,充磁至10000Oe材料的饱和磁化强度达到2.18 emu/g.材料在模拟体液(Simulated body fluid,SBF)中浸泡,短期内可在表面形成羟基磷灰石层,显示出良好的生物活性.是一类十分具有发展潜力的骨修复材料、骨组织工程支架材料及骨癌的热治疗修复材料.
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血清甲胎蛋白和游离β绒毛膜促性腺激素双标记时间分辨荧光免疫试剂盒的研制与评价
目的 研制一种用于产前筛查的母血清甲胎蛋白(AFP)和游离β绒毛膜促性腺激素(free hCG β)双标记时间分辨荧光免疫法(TrFIA)试剂盒.方法 采用AFP单克隆抗体铕(Eu3+)标记物和free hCGβ单克隆抗体钐(Sm3+)标记物作为示踪物,以β-萘甲酰三氟丙酮为主要成分制备增强液,应用双抗体夹心法研制出hAFP和free hCG β双标记时间分辨荧光免疫法试剂盒,并对其进行分析性能评价,平行比对试验采用线性回归分析.结果 自制试剂盒AFP和free hCG β的剂量-反应曲线线性相关系数(r)可达0.999 0以上;批内、批间CV(%)均小于10.00%;AFP和free hCG β的灵敏度分别为0.12 U/ml和0.08 ng/ml;以国家标准品为对照,AFP和free hCG β的标准品效价比在0.900～1.100间;检测AFP和free hCG β的线性范围分别为0.25 U/ml～500 U/ml和0.2 ng/ml～200 ng/ml;试剂盒在4℃保存下可至少稳定12月;与国外同类试剂比对,AFP和free hCG β的回归方程的线性相关系数(r)分别为0.973 0和0.992 7.结论 自制试剂盒具有灵敏度高、特异性强、准确度好、线性范围宽等优点,与国外的同类产品检测结果相关性好,能满足临床需要.
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微波消解-电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)测定蛇床子中16种稀土元素
目的:建立电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)同时测定蛇床子中16种稀土元素(钪、钇、镧、铈、镨、钕、钐、铕、钆、铽、镝、钬、铒、铥、镱、镥)的含量.方法:蛇床子(12批)经微波消解后采用ICP-MS测定,射频功率为1 300W,采样深度为6.8 mm,辅助气、等离子体气和载气流速分别为1.0、16.0和1.17 L· min-1,雾化室温度为2℃;通过在线加入内标铼(Re)和铑(Rh)元素的方法来校正基质效应和干扰.结果:各元素在各自检测质量浓度范围内线性关系良好(r均不低于0.999 3),检出限为0.03～0.32μg·kg-1,回收率为90.1％～105.7％,重复性RSD值为0.9％～3.1％.不同产地的蛇床子中各元素含量差别较大.结论:经方法学验证,本法可用于蛇床子中16种稀土元素的检测,为其质量控制提供参考依据.
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以土霉素-铕作为荧光探针测定胆红素的研究
本文以土零素(OTC)-铕(Eu3+)作为荧光探针,提出了一种荧光光度法测量胆红素(BR)的方法.在pH=7.3的酸度条件下,BR能使OTC-Eu3+位于612nm处的特征荧光显著减弱且减弱的荧光强度与BR的含量成正比.测量的线性范围为5.0x10-7mol/L～3.0x10-5mol/L,检测限为7.7x10-8mol/L.该方法成功地应用于实际样品的测定.
