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血管内皮生长因子165、神经营养因子3、血管生成素1基因转染诱导骨髓间充质干细胞向神经元及血管内皮细胞分化
背景:骨髓间充质干细胞是一种多功能间充质干细胞,具有多向分化潜能,可通过腺病毒转染等方法对其进行基因修饰,使其能够产生多种生长因子,如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、神经营养因子3(neurotrophin 3,NT-3)、血管生成素1(angiopoietin 1,Ang-1)等,从而应用于组织工程研究中.目的:探讨VEGF165、NT-3、Ang-1基因转染大鼠骨髓间充质干细胞向神经元及血管内皮细胞诱导分化的可能性.方法:采用差速贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,进行流式细胞术和成骨、成脂诱导分化能力鉴定.以巨细胞病毒(CMV)作为启动子,构建2个腺病毒载体,其一为双顺反子载体,携带hVEGF165及Ang-1基因(Adv-Bic);其二为携带NT-3基因载体,即AdvNT-3.以不同感染复数值将Adv-Bic(绿色荧光)及AdvNT-3(红色荧光)同时转染大鼠骨髓间充质干细胞,转染2 d后根据荧光显微镜下绿色及红色荧光蛋白表达情况确定佳感染复数值.将生长良好的第3代骨髓间充质干细胞分为2组,实验组以适感染复数值转染Adv-Bic(无荧光标记)及AdvNT-3(无荧光标记);对照组以相同感染复数值转染空白对照病毒.两组分别于体外培养7 d后进行免疫荧光及qPCR检测.结果与结论:①间质干细胞表面分子CD29、CD44呈阳性表达,造血干细胞表面分子CD34、CD45呈阴性表达.骨髓间充质干细胞能够定向分化为成骨细胞及脂肪细胞;②病毒转染骨髓间充质干细胞48 h后荧光显微镜下观察有绿色及红色荧光蛋白表达,随着感染复数值增大荧光表达量逐渐增强,感染复数值为100时荧光表达强烈;③免疫荧光及qPCR结果显示,实验组VEGF165、NT-3、Ang-1表达水平高于对照组,且血管内皮特异性标记物CD31、CD34表达水平高于对照组,神经元特异性标记物NSE、Nestin表达水平高于对照组;④结果提示,VEGF165、NT-3、Ang-1基因转染骨髓间充质干细胞,使其过表达VEGF165、NT-3、Ang-1生长因子,能够诱导骨髓间充质干细胞定向分化为神经元及血管内皮细胞.
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组织工程骨构建的研究进展
近年来组织工程技术的迅速发展为骨缺损的治疗开辟了新的思路,其基本原理为在体外构筑支架材料-种子细胞-生长因子复合物,然后移植到骨缺损处,经过材料的吸收和组织的增生,实现自身骨组织代替组织工程骨,终实现骨的形态和功能上的修复.种子细胞及支架材料是组织工程骨构建的核心,通过对种子细胞的成骨诱导以及对支架材料理化性能的改良可以提高组织工程骨促进骨生成及修复的效能.既往研究表明血管及神经分布对骨形成具有一定的促进作用,因此对组织工程骨进行血管化和神经化也能达到相似效果.随着组织工程技术的发展,目前通过复合构建已制造出具有一定功能的简单组织结构.
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组织工程骨神经化构建的组织学研究
[目的]通过观察不同神经束植入组织工程骨后组织学的变化,探讨组织工程骨神经化构建的效果.[方法]将新西兰大白兔的骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs )进行诱导分化为成骨细胞,与β-磷酸三钙(β-tricalcium phosphate,β-TCP)复合制作组织工程骨,分别将不同类型神经束植入组织工程骨,进行以下分组:A组,组织工程骨组; B组,感觉神经束植入组; C组,运动神经束植入组; D组,血管束(含有自主神经)植入组; E组,感觉、运动神经束联合植入组.分别用于修复兔股骨1.5 cm大段骨缺损;各组分别在12周进行组织学的Masson染色,降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)的免疫组织化学检测,并进行统计学分析,以比较骨缺损修复情况.[结果]在观察期内,有感觉神经植入的组别和血管束植入的组别在组织学上具有明显骨化作用,而运动神经束植入却没有明显的促进作用.[结论]感觉神经束和血管束具有明显的促组织工程骨成骨作用,可以作为组织工程骨神经化构建的一种方法.
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组织工程骨神经化构建的影像学研究
目的 通过影像学观察不同神经束植入组织工程骨后对成骨活动的影响,探讨组织工程骨神经化构建的方法.方法 将新西兰大白兔的骨髓基质干细胞(Bone marrow stromal cells,BMSCs)进行诱导分化为成骨细胞,与β-磷酸三钙(β-tricalcium phosphate,β-TCP)复合制作组织工程骨,分别将不同类型神经束植入组织工程骨,进行以下分组:A组,组织工程骨组;B组,感觉神经束植入组;C组,运动神经束植入组;D组,血管束(含有自主神经)植入组;E组,感觉、运动神经束联合植入组.分别用于修复兔股骨1.5cm骨缺损;各组分别在术后4、8、12周进行放射学检查,并在12周进行大体标本、骨密度检测用以比较骨缺损修复情况.结果 在观察期内,有感觉神经植入的组别和血管束植入的组别具有明显的促组织工程骨骨化作用,而运动神经束植入却没有明显的促进作用.结论 感觉神经束和血管束具有明显的促组织工程骨成骨作用,可以作为组织工程骨神经化构建的一种方法.
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神经植入对大段组织工程骨成骨效果的一年观察
目的 观察在组织工程骨内植入神经束后大段组织工程骨的长期成骨效果.方法 新西兰大白兔64只,随机分为四组:A组,单纯组织工程骨组;B组,运动神经束植入组(股神经肌支);C组,感觉神经束植入组(隐神经);D组,感觉、运动神经束联合植入组.每只动物均在左侧股骨制作长1.5 cm的段缺性骨与骨膜缺损,钢板固定后在骨缺损处分别植入四种方法制备的组织工程骨.术后1、3、6、12个月行大体观察、X线和组织学定量观察成骨情况. 结果 术后1、3、6个月时,在组织工程骨内植入感觉神经或联合植入两种神经后,比单纯组织工程骨和运动神经束植入的修复效果均有明显提高.术后12个月时,各组骨再生情况基本一致,但新生骨组织出现一定程度的吸收,其外观较正常股骨细,新生骨组织与兔股骨牢固愈合,并开始塑形且出现髓腔再通. 结论 在组织工程骨内植入感觉神经可促进成骨,而植入运动神经未见促进作用;组织工程骨可以修复兔大段骨缺损;该实验新生骨组织的吸收可能与模型的制作方法有关.
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周围神经及骨代谢与组织工程骨的构建
创伤、感染、肿瘤等疾患常常造成骨组织缺损,引起功能障碍.其临床治疗可采用自体骨移植、同种异体骨移植、异种骨移植等方法,但这些方法由于供源有限、免疫排斥 、感染等原因,故均有其局限性.骨组织工程研究的终目的是将骨组织工程技术及产品应 用于临床,修复患者骨缺损.植物神经纤维随支配骨的脊神经和骨滋养动脉进入骨组织,通 过分泌包括神经肽在内的多种多肽类生物活性物质影响骨的营养和代谢状态以及血管的发生 和长入.我们在总结血管、周围神经系统和各种肽对骨代谢的影响后,为寻求一种生理环境 下更接近体内自然状态的组织工程骨愈合方式,提出了组织工程骨的神经化构建观点,对组织工程骨神经化构建的方法、现状、前景与研究思路进行了叙述.
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骨骼肌组织工程研究进展
骨骼肌组织工程是组织工程学研究较少的一个领域,以往有关骨骼肌组织工程的综述类文献,都局限于从种子细胞、生物材料及生长因子等方面论述.而近年来本领域研究成果不断涌现,本文结合新国内外文献,从组织工程骨骼肌构建的基本问题到其血管化、神经化等方面,对骨骼肌组织工程研究现状进行回顾,并对其研究前景作一展望.
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神经化组织工程骨构建的初步观察
目的评估两种组织工程骨体内神经化重建方法的成骨效果,研究神经化与成骨的相互关系.方法 24只新西兰大白兔随机分成四组:组织工程骨组(A组),感觉神经束植入组(B组),运动神经束植入组(C组),血管束植入组(D组).每只动物均制备左侧股骨长1.5cm的段缺性骨与骨膜缺损,钢板固定后骨缺损处分别植入用四种方法制备的组织工程骨.植入的神经分别是隐神经和股神经肌支.术后4、8、12周摄股骨正位X线片,用放射影像学评分和X线阻射影分析比较骨缺损修复情况.结果在组织工程骨中植入感觉神经束后,比单纯组织工程骨和运动神经束植入的修复效果均有明显提高,而在组织工程骨中植入运动神经束与单纯组织工程骨修复骨缺损的效果相比较无明显差异,感觉神经束植入与血管束植入的成骨效果比较无明显差异,血管束植入组的成骨效果优于其它两组.结论利用感觉神经束植入的方法可以提高组织工程骨的成骨作用,而植入运动神经束却无此作用.
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显微外科技术构建家兔股动脉局部去交感神经模型
目的 研究显微外科技术在体内去除兔股动脉交感神经的可行性,排除血管外膜交感神经的影响,为进一步研究组织工程骨神经化机制提供可靠的动物实验模型.方法 2014年7月至2015年7月,将21只新西兰大白兔随机分4组:对照组(n=3)、4周组(n=6)、8周组(n=6)、12周组(n=6).分离21只新西兰大白兔双侧股动脉,实验组于股动脉中段剥除血管外膜,对照组仅做分离.于术后4周、8周、12周分别取材行苏木精-伊红(HE)染色观察血管壁结构、乙醛酸荧光染色观察交感神经分布及其荧光强度、Western blot检测交感神经特异性蛋白酪氨酸羟化酶(TH)的含量.结果 HE染色的结果:对照组动脉血管各层结构完整,3个实验组动脉外膜层缺失或明显变薄.乙醛酸染色结果:对照组、4周组、8周组、12周组的荧光强度A值分别为0.8626±0.03519、0.3631±0.03019、0.3964±0.02239、0.3487±0.02356,各实验组相比对照组荧光分布范围明显缩小,荧光强度显著减弱,差异有统计学意义(P＜0.05),各实验组之间的荧光强度差异无统计学意义(P＞0.05).Western blot结果:对照组、4周组、8周组、12周组WB条带半定量分析值分别为0.08124±0.00260、0.02920±0.00206、0.02661±0.00233、0.03094±0.00211,各实验组与对照组相比,TH的含量均明显减少,结果具有统计学意义(P＜0.05);而3个实验组间差异无统计学意义(P＞0.05).结论 显微外科手术剥除法可有效去除动脉血管外膜的交感神经.该方法作用持久,交感神经去除彻底且在4周、8周、12周3个观察点内无论从神经递质方面还是特异性蛋白方面都没有观察到交感神经的明显再生,故该方法可为研究单纯血管因素对组织工程骨的影响提供持久、有效、可靠的动物模型.
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雪旺细胞对BMSCs来源内皮细胞分泌一氧化氮的作用研究
目的 研究雪旺细胞(Schwann cells,SCs)对BMSCs来源内皮细胞分泌一氧化氮(nitric oxide,NO)功能的影响,为进一步探究组织工程骨成骨过程中神经因素对血管因素的作用奠定实验基础. 方法 取1日龄SD乳鼠坐骨神经及臂丛神经,体外分离获取SCs,采用S-100免疫组织化学染色鉴定;取2周龄SD大鼠胫骨及股骨骨髓,体外分离获取BMSCs,诱导分化成为内皮细胞,采用血管性血友病因子与CD31免疫荧光染色鉴定.采用Transwell共培养板对SCs与BMSCs来源内皮细胞进行非接触共培养作为实验组,单纯培养BMSCs来源内皮细胞作为对照组,分别于1、3、5、7d检测培养液中NO浓度,1、3、7、10d采用实时荧光定量PCR (real-time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR)检测一氧化氮合酶2(nitric oxide synthetase 2,NOS2)、NOS3 mRNA表达. 结果 分离及诱导分化的细胞通过形态学及免疫组织化学和免疫荧光染色鉴定为SCs和内皮细胞.实验组及对照组内各时间点间释放NO浓度比较,差异均有统计学意义(P＜0.05);除3d外,其余各时间点实验组释放NO浓度均显著高于对照组(P＜0.05).RT-qPCR检测结果示,培养各时间点实验组NOS2 mRNA相对表达量均显著高于对照组(P＜0.05);两组内各时间点间比较差异均有统计学意义(P＜0.05).除10d外,其余各时间点实验组NOS3 mRNA相对表达量均显著高于对照组(P＜0.05);实验组内各时间点间NOS3 mRNA相对表达量比较差异均无统计学意义(F=6.673,P=0.062),对照组内各时间点间比较差异均有统计学意义(F=36.581,P=0.000). 结论 SCs可促进BMSCs来源内皮细胞释放NO,可能与SCs促进NOS活性有关.
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骨组织工程技术瓶颈及其原因分析
组织工程骨的研究发展迅速,但仍存在许多问题.主要的瓶颈是培养的细胞在功能和行为上与体内的细胞有较大差异,组织工程骨的成骨能力存在缺陷,形成的组织工程骨与天然的生理骨仍有较大差距.可能的原因是细胞的培养微环境不够完善,没有实现组织工程骨的同步血管化和神经化,组织工程骨与骨膜复合体的构建目前仍缺乏研究.
