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细胞内La表达对乙肝病毒复制的影响研究
目的:研究细胞内La的表达对HBV病毒复制的影响.方法:针对人La蛋白序列设计并合成特异性的SiRNA,转染稳定表达HBV的HepG2.2.15细胞,实时荧光定量PCR测定HepG2.2.15细胞中La mRNA变化水平及HBV DNA复制水平.结果:特异性SiRNA干扰La蛋白的mRNA表达,使La在HepG2.2.15细胞中的表达降低;HepG2.2.15细胞分泌在培养上清液中的HBV DNA水平显著下降,相关性分析结果显示,HBV DNA变化水平与La mRNA变化水平呈正相关.结论:细胞内La可以保护HBV RNA免受核酸酶的破坏、促进HBV病毒复制.
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灵猫方对HepG2.2.15和HepAD38细胞La蛋白表达的影响
目的 研究灵猫方对HepG2.2.15和HepAD38细胞cccDNA、pgRNA、sRNA和La-mRNA抑制作用,探讨灵猫方抗乙肝病毒(HBV)的作用机制.方法 制备灵猫方水提物,500 mg/L和1 000 mg/L灵猫方水提物分别干预HepG2.2.15和HepAD38细胞,以0.9％ NaCl溶液作为空白对照组,6d后收集培养液上清,ELISA法检测HBsAg和HBeAg水平;收集细胞提取总RNA,RT-PCR法检测细胞内cccDNA、pgRNA、sRNA和La mRNA表达水平.结果 与空白对照组比较,灵猫方组的HepG2.2.15和HepAD38细胞的HBsAg和HBeAg分泌水平明显降低,细胞内cccDNA、pgRNA、sRNA和La mRNA表达水平明显降低(P≤ 0.01).结论 灵猫方可能通过抑制HepG2.2.15和HepAD38细胞内La蛋白的表达而促进pgRNA、sRNA和cccDNA的降解,从而抑制HBV的复制.
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细胞内La蛋白对乙型肝炎病毒蛋白质表达的影响
目的 探讨细胞内La蛋白对HBV蛋白质表达的影响.方法 针对人La蛋白序列设计特异性的小分子干扰RNA(siRNA),通过体外转录的方法合成双链siRNA,并转染进入稳定表达HBV的HepG2.2.15细胞,实时荧光定量基因扩增技术测定HepG2.2.15细胞中的La蛋白mRNA变化水平;电化学发光分析技术检测HepG2.2.15细胞分泌的HBsAg和HBeAg变化情况.所得数据进行配对假设检验的统计学分析.结果 特异性siRNA干扰La蛋白mRNA的表达,使La蛋白在HepG2.2.15细胞中的表达降低;HepG2.2.15细胞分泌在培养上清液中的HBsAg和HBeAg表达显著下降,相关性分析显示,HBsAg、HBeAg变化水平与La蛋白mRNA变化水平呈正相关,相关系数分别为0.938和0.899.结论 特异性siRNA能够抑制细胞内La蛋白mRNA的表达,La蛋白可通过某种方式影响HBV蛋白质的表达.
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La蛋白与HBV RNA相互作用关系的研究进展
新近研究发现,人类La蛋白(human La protein,hLa)是一种与HBV RNA转录调节相关的因子.La蛋白可能结合在HBV RNAs的茎环结构上,具有保护乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV)RNA,促进其翻译启动的作用,可能是HBV RNA的稳定因子.当La蛋白发生突变后将无法与HBV RNA结合,丧失保护HBV RNA的功能,使其受到酶的降解,无法转录翻译,病毒的复制受阻,从而抑制HBV感染.本文综述了La蛋白、HBV RNA及核酶(nuclear RNases)三者间相互作用关系的新研究成果,从分子水平上探讨了导致HBV RNA降解的可能机制,推测了野生型和突变型La蛋白对乙型肝炎病毒RNA的翻译启动和病毒复制的影响.
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La蛋白结合位点缺失的HBeAg mRNA在细胞内的稳定性
目的 观察乙型肝炎病毒e抗原mRNA(HBeAg mRNA)上La蛋白结合位点的缺失对其细胞内稳定性的影响,从而进一步研究这个位点在乙肝病毒生命周期中的作用.方法 针对HBeAg mRNA上La蛋白结合位点,在HBV DNA水平上利用PCR定点突变技术.构建突变型HBV载体,使其转录出来的HBeAg mRNA缺失La蛋门结合化点,将其命名为pHBV-mLa;应用脂质体将突变型HBV载体瞬时转染HepG2细胞,同时将转染了野生型HBV载体的细胞作为对照组;在各组中,用半定量逆转录PCR(RTPCR)检测HBeAg mRNA,同时酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞培养上清中HBeAg.结果 酶切鉴定和碱基测序证明,成功构建了La蛋白结合相关位点部分碱基缺失的突变型HBV载体-pHBV-mLa.转染后半定量RT-PCR检测发现,突变后HBeAg mRNA水平明显低于未突变的对照组,ELISA检测发现突变组中HBeAg表达下调.结论 HBV-DNA上引入的突变可以破坏HBeAg mRNA上La蛋白结合位点,影响HBeAg mRNA在细胞内的稳定性.HBeAg mRNA上La蛋白结合位点对乙肝病毒生命周期至关重要.
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La蛋白质家族与肿瘤关系
La蛋白相关家族(La-related proteins,LARPs)包括LARP1、LARP1b、LARP3,(Genuine La)、LARP4a、LARP4b、LARP6和LARP7.LARPs结构包含中度保守的RNA识别模体(RNA recognition motif,RRM)和多个其他结构、运输元件,可定位于不同的亚细胞部位与RNA相互作用,在细胞转录和翻译等方面发挥重要的作用.人LARPs初是在系统性红斑狼疮和Sjogren's综合征患者的血清内发现的自体抗原,目前随着研究深入普遍认为LARPs作为一种RNA分子伴侣参与RNA代谢能发挥多种生物学功能.此前国内有学者研究验证LARPs能稳定乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)的mRNA,帮助其在肝细胞中复制与翻译,在乙型肝炎进展中具有重要作用.近年发现,LARPs在多种恶性肿瘤如子宫颈癌、乳腺癌、肝癌和前列腺癌等的细胞增殖、分化、迁移、血管形成的调节等方面起重要作用.而恶性肿瘤的发生与演进是由环境与遗传因素相互作用而导致的许多基因突变,实际上基因突变产生的编码蛋白质执行细胞生命活动,因而LARPs在肿瘤中扮演的分子角色将可能在肿瘤的诊断与治疗中提供潜在的新靶点、新策略和新途径.
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La以及La相关蛋白在肝癌细胞中的表达和意义
目的 研究La以及La相关蛋白(La-related protein, LARPs)在正常肝细胞和肝癌细胞中的表达水平.方法 采用RT-PCR技术检测La、LARP1、LARP1B、LARP4B在人正常肝细胞和5株肝癌细胞系中的表达情况.结果 与正常肝细胞相比,La以及La相关蛋白基因在肝癌细胞中的表达普遍明显高于正常肝细胞,差别具有统计学意义.其中La蛋白基因在HepG2.2.15细胞中表达高.结论 La以及LARPs基因在多株肝癌细胞中过度表达,La蛋白或可成为HBV阳性肝癌早期诊断、预防的新标记物和治疗的新靶点.
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RNA结合蛋白La在宫颈癌组织中的表达及临床意义
目的 探讨RNA结合蛋白La在宫颈癌组织中的表达及在宫颈癌发生、发展过程中的作用.方法 采用免疫组化染色技术分别测定La蛋白在宫颈癌和正常宫颈组织中的表达情况；采用RNA干扰技术沉默La基因在宫颈癌细胞株HeLa的表达,并通过G418筛选,构建稳定表达的HeLa的La干扰克隆.然后使用HeLa-shLa和HeLa-shNC分别进行细胞增殖、体外肿瘤球形成实验,细胞周期检测和Western blot等.结果 宫颈癌组织中La蛋白的表达61％明显高于正常宫颈组织9％,差异有统计学意义(P＜0.05)；且干扰La后,HeLa细胞的增殖能力及肿瘤球形成率(shNC组:17.1％士1.92％,shLa组:6.3％士0.45％)均出现降低,与载体对照组相比,差异具有统计学意义(P＜0.05).此外La蛋白干扰后,HeLa细胞发生明显的G0/G1期阻滞,且细胞内CyclinD1的表达降低.结论 RNA结合蛋白La对宫颈癌的形成具有促进作用,可能在宫颈癌的发生、发展中起重要作用.
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乙型肝炎病毒RNA上La蛋白结合位点缺失对S基因mRNA稳定性的影响
目的研究乙型肝炎病毒(HBV)RNA上La蛋白结合位点的缺失对S基因mRNA在细胞内稳定性的影响,评价HBV RNA上这个位点对HBV生命周期的重要性,从而寻找新的抗HBV靶点.方法构建HBV突变载体,使其转录出来的HBV RNA缺失La蛋白结合位点;计算机预测突变后这个位点所在的HBV RNA片段的二级结构;将未突变的HBV载体和HBV突变载体分别瞬时转染HepG2细胞;半定量逆转录聚合酶链反应法检测HBV S基因的mRNA,酶联免疫吸附法检测乙型肝炎表面抗原.结果酶切鉴定和测序证明,成功构建了La蛋白结合相关位点部分碱基缺失的HBV突变载体--pHBV-mLa;突变后的HBV RNA二级结构同突变前的比较,完全改变;转染细胞后半定量逆转录聚合酶链反应法检测发现,突变后HBV S基因的mRNA水平显著降低(t'=12.703,P＜0.05);酶联免疫吸附法检测发现突变引起乙型肝炎表面抗原表达明显下调(t=44.648,P＜0.01).结论HBV RNA上La蛋白的结合位点以及局部特殊二级结构的形成,影响着自身转录后的稳定性,对于HBV的生命周期至关重要.
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La蛋白与乙型肝炎病毒mRNA稳定性和蛋白质表达的相关性
目的 研究La蛋白与乙型肝炎病毒(HBV)mRNA稳定性和蛋白质表达之间的相关性.方法 设计并合成La蛋白mRNA特异性小干扰RNA(siRNA),转染HepG2.2.15细胞,继续培养3 d后分别裂解转染和未转染siRNA的细胞;抽提蛋白质,Western blot检测La蛋白含量变化;于转染后的第1、2、3、5、7、9天分别收集细胞培养上清液,实时荧光定量聚合酶链反应技术检测上清液中HBV DNA的变化情况,电化学发光分析技术检测乙型肝炎表面抗原,乙型肝炎e抗原含量变化情况.结果 La蛋白在转染siRNA的HepG2.2.15细胞中表达明显低于未转染siRNA的细胞;转染siRNA的细胞分泌到上清液中乙型肝炎表面抗原、乙型肝炎e抗原和HBV DNA的含量也明显低于未转染siRNA的细胞.结论 在HepG2.2.15细胞内,La蛋白与HBV mRNA稳定性和蛋白质表达具有功能相关性.
