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p53信号稳态调节线粒体能量代谢延缓衰老的运动适应
解决肿瘤和衰老的关键是要在肿瘤和衰老发生、发展机制的基础研究上取得突破,近年取得了广泛而深入的成就.其中引人注目的是p53(肿瘤抑制因子)基因的作用.
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沉默TIGAR基因对非小细胞肺癌细胞增殖和代谢的影响
目的:通过沉默TIGAR(Tp53 induced glycolysis and apoptosis regulator)基因,探讨其对非小细胞肺癌细胞增殖及代谢的影响及可能的机制.方法:用靶向TIGAR的siRNA沉默TIGAR,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)及蛋白印迹(WB)分别检测TIGARmRNA和蛋白表达水平,将敲除效率较好的敲除序列包装进重组慢病毒感染细胞构建稳定敲减TIGAR的细胞.通过CCK-8法、软琼脂克隆形成、FCM法分别检测细胞的增殖速率、克隆形成能力和细胞周期分布;蛋白印迹法检测TIGAR沉默后周期相关蛋白CDK4和p27的表达情况.RT-qPCR检测TIGAR对糖代谢相关酶表达的影响;18F-FDG、1-14C、6-14C摄取实验分别检测相应的代谢流量,乳酸试剂盒和ROS试剂盒分布检测细胞乳酸生成和ROS水平.结果:转染siTIGAR或感染shTIGAR病毒后细胞TIGAR表达水平明显下降(P值均＜0.005).成功构建了两株稳定敲减TIGAR的非小细胞肺癌细胞株,shTIGAR组细胞增殖速率和克隆形成能力明显下降,细胞周期阻滞在G0/G1期,P27蛋白明显上调,CDK4蛋白明显下调.沉默TIGAR促进细胞糖酵解速率和乳酸生成,抑制磷酸戊糖途径和氧化磷酸化,细胞ROS生成增加尤其是低氧情况下(P值＜0.05).结论:下调TIGAR表达的非小细胞肺癌细胞增殖能力下降,其机制可能与调控CDK4和P27表达及代谢流量再分布相关.
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抑制TIGAR表达可以增加非小细胞肺癌细胞对化疗药物的敏感性
目的:探讨小干扰RNA (small interfering RNA,siRNA)抑制TP53诱导的糖酵解和凋亡调节因子(TP53-induced glycolysis and apoptosis regulator,TIGAR)表达后对肺腺癌A549细胞化疗敏感性的影响及其可能的作用机制.方法:化学合成针对TIGAR基因的特异性siRNA片段(siRNA-TIGAR)和对照干扰片段(siRNA-control).将siRNA-TIGAR或siRNA-control转染至A549细胞后,应用实时荧光定量-PCR和蛋白质印迹法检测细胞中TIGAR mRNA及蛋白的表达,CCK-8(cell counting kit-8)法检测依托泊苷、5-氟尿嘧啶、顺铂、依托泊苷联合N-乙酰L-半胱氨酸和H2O2作用后细胞的存活率,FCM法检测H2O2作用后细胞的凋亡率及细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平.结果:siRNA-TIGAR转染组A549细胞中TIGAR mRNA及蛋白的表达水平明显下降(P＜0.01);依托泊苷、5-氟尿嘧啶和顺铂对siRNA-TIGAR转染组A549细胞的半数抑制浓度(half inhibitory concentration,IC50)明显降低(P＜0.05); H2O2作用后,siRNA-TIGAR转染组A549细胞的存活率下降、凋亡率和细胞内ROS水平上升(P＜0.05);依托泊苷联合N-乙酰L-半胱氨酸作用后,siRNA-TIGAR转染组和siRNA-control转染组A549细胞对依托泊苷敏感性之间的差异无统计学意义(P＞0.05).结论:抑制TIGAR的表达可以增强A549细胞对化疗药物的敏感性,其机制可能与细胞内ROS水平的改变有关.
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T IGAR 调节肺癌细胞的增殖和侵袭能力研究
目的：探讨 P53下游基因 TIGAR 在肺癌细胞 A549增殖、迁移及侵袭中的作用。方法采用 siRNA 技术在 A549细胞中干扰 TIGAR 的表达，细胞计数试剂盒（ CCK-8）检测细胞增殖，小室法检测细胞迁移，肿瘤细胞侵袭实验检测细胞侵袭，免疫印迹杂交检测相关蛋白水平变化。结果在 A549细胞中成功干扰 TIGAR 后，细胞增殖显著降低（P＜0．05），细胞迁移和侵袭能力显著减弱，侵袭相关蛋白基质金属蛋白酶2（MMP-2）和基质金属蛋白酶9（MM P-9）的表达量均下调。结论 TIGAR 促进肺癌细胞 A549的增殖，并促进细胞的迁移和侵袭能力。
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IL-13对与成纤维细胞共培养的乳腺癌细胞表达Bcl-2和TIGAR的影响
目的 探索白细胞介素-13(interleukin-13,IL-13)对乳腺癌作用的分子机制.方法 采用Transwell小室方法共培养人乳腺癌细胞与人成纤维细胞;RT-qPCR和Western blot检测IL-13对乳腺癌细胞抗凋亡因子B-cell lymphoma-2(Bcl-2)和TP53-induced glycolysis apoptosis regulator (TIGAR)表达的影响;AnnexinV和CCK-8实验检测IL-13对乳腺癌细胞凋亡和增殖的影响.结果 IL-13上调了与人成纤维细胞CCC-ESF-1 (ESF)共培养的人乳腺癌细胞BT-474的抗凋亡因子Bcl-2和TIGARmRNA和蛋白的表达.与其他各组比较,BT-474+ESF+IL-13组BT-474细胞的Bcl-2和TIGAR表达显著上调(P＜0.05);加入IL-13可抑制BT-474细胞的凋亡,与BT-474+ESF共培养组比较,BT-474+ESF+IL-13共培养组的早期调亡的BT-474细胞下降了10.85倍;IL-13促进了BT-474细胞增殖,BT-474+ESF+IL-13组与各组比较,培养48 h、72h、96 h和120 h后,BT-474细胞的增殖显著高于其它各组(P＜0.05).结论 IL-13可上调与人成纤维细胞共培养的人乳腺癌细胞BT-474抗凋亡因子Bcl-2和TIGAR的表达;IL-13对乳腺癌作用的分子机制涉及Bcl-2和TIGAR.
