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急性心肌缺血对骨髓Nkx2-5+心脏祖细胞的动员作用
骨髓源性Nkx2-5+心脏祖细胞(bone marrow-derived Nkx2-5+ cardiac progenitor cells)具有高度特异性分化为心肌细胞的潜能,在病理状态下可能参与内源性心肌修复.但在器官缺血、特别在急性心肌缺血病理状态下,该细胞如何被动员的机制尚不清楚.本研究在观察Nkx2-5+心脏祖细胞存骨髓中分布特征的基础上,分析急性心肌缺血对骨髓源性Nkx2-5+心脏祖细胞的动员作用,探讨其细胞动员的可能机制.分别建立小鼠急性心肌缺血及脑、后肢急性缺血动物模型.采用纳米金-银免疫标记透射电镜、免疫荧光标记及分子生物学等检测方法,观察骨髓Nkx2-5+心肌祖细胞的定位及其形态学特征:检测急性心肌缺血后外周血Nkx2-5+细胞比例变化、缺血不同时段骨髓及外周血中Nkx2-5蛋白表达的变化;比较不同器官缺血对Nkx2-5+心脏祖细胞的动员作用;应用SDF-1/CXCR4通路特异性阻断剂AMD3100,分析SDF-1在急性心肌缺血后对Nkx2-5+心脏祖细胞动员作用的影响.结果显示:Nkx2-5+心脏祖细胞呈散在分布于骨髓血窦旁.与对照组相比,急性心肌缺血后,外周血Nkx2-5+心脏祖细胞比例显著增加(P<0.01).心肌缺血早期(1 d),外周血Nkx2-5蛋白表达显著增加(P<0.01),并可持续7 d;而此间,骨髓中Nkx2-5蛋白表达立即升高,随后则降低.应用AMD3100阻断剂后,心肌缺血组外周血Nkx2-5蛋白表达受到明显抑制(P<0.05).脑、后肢缺血后,外周血Nkx2-5蛋白表达显著少于急性心肌缺血组(P<0.01),而与对照组相比无显著筹异.上述结果提示,生理状态下,骨髓中存在Nkx2-5+心脏祖细胞亚群;急性心肌缺血对骨髓Nkx2-5+心脏祖细胞具有显著的动员作用,且该动员作用具有显著的器官特异性,SDF-1/CXCR4通路在该动员作用中发挥了重要的趋化作用.
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小鼠心脏成纤维细胞直接转分化为心脏祖细胞的实验研究
目的：采用非特异性转录因子介导的谱系重编程系统，将小鼠心脏成纤维细胞（ cardiac fibroblasts ， CFs）直接转分化为心脏祖细胞（ cardiac progenitor cells ，CPCs）。方法取昆明小鼠乳鼠心肌组织，差速贴壁法分离CFs。免疫荧光染色、流式细胞术分别检测CFs性状及纯度，以携带含小鼠tet－on系统的4种重编程因子Oct4、Sox2、Klf4、c－myc（OSKC）慢病毒等比例感染第3代（P3）CFs。 A组：感染含小鼠tet－on系统的OSKC慢病毒，重编程培养基中不加入白血病抑制因子（LIF），加入JAK inhabit 1（JI1），以抑制向iPSCs方向的转分化。 B组：对照组感染空载体病毒。 C组：感染含小鼠tet－on系统的OSKC慢病毒，重编程培养基中加入LIF，不加入JI1，不抑制向iPSCs方向的转分化。在特定时间点为感染的细胞更换不同培养条件，观察细胞形态及生物特性的变化：①实时荧光定量PCR（Real time－PCR）法检测重编程各个时间点CPCs特异性转录因子Mesp1、Nkx2．5、Isl1、GATA4及胚胎干细胞多能性因子Oct4、Sox2、c－myc、Klf4、Naong的表达；②CPCs特异性标记Nkx2．5、Isl1免疫荧光染色鉴定；③CPCs自分化为搏动心肌细胞的检测；④心肌细胞特异性标记cTnI免疫荧光染色鉴定CPCs向心肌细胞方向的分化潜能。结果①形态学观察，病毒感染11～14天，可见部分CFs形态发生改变，形成CPCs样克隆；②CPCs克隆Nkx2．5、Isl1免疫荧光染色阳性；③CPCs可自分化为搏动的细胞团，其中的细胞cTnI免疫荧光染色阳性；④Real－time RCR检测结果显示，重编程第4天，CPCs早期特异性转录因子Mesp1即开始表达，而iPSCs多能性因子Naong在重编程第9天才开始表达。结论心脏成纤维细胞可以直接转分化为CPCs。
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成年大鼠心脏祖细胞的体外分离、培养和鉴定
目的 探索从成年大鼠心脏组织中分离、培养心脏祖细胞(CPCs)的有效方法.方法 取SD大鼠心脏,经胰蛋白酶和胶原酶Ⅳ消化后,置于组织块培养基中培养,取组织块周围爬出的小、圆、亮的细胞置于心球生长培养基中培养,予以免疫组织化学鉴定.结果 2周左右可见小、圆、亮的细胞附着在组织块周围爬出的成纤维细胞层上,且其c-kit表达阳性.结论 经胰蛋白酶和胶原酶Ⅳ消化的方法可以成功地对成年大鼠的CPCs进行分离和体外培养.
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桃叶珊瑚苷通过 ERβ途径抑制 TNF－α诱导的心脏祖细胞凋亡
目的：桃叶珊瑚苷（ aucubin， AU）是杜仲、车前草、地黄等中草药的有效成分之一。现代药理学研究发现， AU对免疫、心脑血管、神经系统均有保护作用，但其作用机制尚不清楚。课题组前期研究证实AU可激活雌激素受体，提示AU可能通过雌激素信号通路发挥心血管保护作用。近年来越来越多的证据表明，心脏祖细胞（ cardiac progenitor cells ， CPCs）在心肌缺血组织损伤修复中发挥重要作用。方法为了进一步阐明AU的作用机制，该研究以小鼠CPCs为细胞模型，采用IncuCyte活细胞成像、TUNEL、Western blot、定量PCR等方法探讨了AU对肿瘤坏死因子－α（ tumor necrosis factor－α，TNF－α）诱导的CPCs凋亡的影响及其作用机制。结果 AU可以降低由TNF－α诱导的CPCs凋亡，降低caspase－3蛋白质表达，上调Bcl－2／Bax水平，雌激素受体β（ estrogen receptor β，ERβ）抑制剂可阻断AU的抗凋亡作用，同时AU可使ERβ表达升高。结论 AU可以抑制由TNF－α诱导的CPCs凋亡，其部分作用机制为ERβ通路的激活。
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细胞自噬在胚胎心管形成过程中的作用
目的：细胞自噬是溶酶体参与降解多种细胞内容物的过程，具有重要的病理及生理学作用，本研究主要关注细胞自噬是否在胚胎发育早期心管形成中也具有重要作用。方法：应用鸡胚为模式动物，采用免疫荧光的方法研究自噬相关基因7（ auto－phagy－related gene 7，ATG7）在胚胎早期的表达模式，随后用雷帕霉素（ RAPA）、3－甲基腺嘌呤（3－MA）等分别处理胚胎，用Time－lapse拍摄心脏祖细胞的迁移模式，免疫荧光、原位杂交等方法检测ATG7、LC3、MF－20、GATA4、GATA5等基因的表达情况。结果：RAPA和3－MA能够分别影响ATG7、E－Cadherin等基因的表达模式，导致胚胎早期上皮细胞向间充质细胞转化紊乱；高葡萄糖环境或酒精处理能够过度激活胚胎发育过程中的细胞自噬，导致胚胎心管肥大或者融合异常，这与RAPA处理的胚胎心管畸形极为相似；细胞自噬过度激活影响心脏祖细胞迁移和GATA4、GATA5等心管生成基因的表达。结论：妊娠合并糖尿病及妊娠期饮酒等因素会导致胚胎发育环境中细胞自噬的过度激活，从而影响细胞内的蛋白降解异常和细胞分化异常等，终导致胚胎心管发育畸形。
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成纤维细胞向心脏祖细胞重编程过程中能量代谢变化研究
目的：提高蛋白进入细胞的效率及细胞重编程效率，同时观察重编程过程中的能量代谢。方法：采用专利技术将GATA4、HAND2、MEF2C和TBX5（GHMT）高效转导到皮肤成纤维细胞株（HDF），检测转导效率和向心脏祖细胞的转分化效果，并检测能量代谢关键酶的变化。结果：纳米修饰后的蛋白能高效转导到细胞核内。心肌祖细胞标志基因GATA4等表达显著上调， Col1a2和vimentin表达显著下降。糖酵解途径关键调控因子葡萄糖转运蛋白1、己糖激酶和乳酸脱氢酶A在重编程后表达上调。有氧氧化途径的关键酶丙二酰辅酶A脱羧酶和脂酰转移酶1b表达下调。结论：采用GHMT诱导得到的心脏祖细胞有胚胎心肌类似的能量代谢方式，具体调控机制还需进一步研究。
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AF9促进心脏祖细胞的生成及机制研究
目的：组蛋白乙酰化修饰是表观遗传调控中重要的调控方式之一，组蛋白乙酰化与基因活化关系密切，其中一个重要环节是被特定阅读器结构域所识别，从而招募染色质调控因子到特定区域，协同完成基因表达调控。 AF9是这类阅读器之一，其
是否参与心脏发育分化还未清楚。因此本研究探讨心脏转录因子联合AF9是否对心脏祖细胞的产生具有促进作用。方法：采用蛋白重组表达方式获得心脏转录因子GATA4、NKX2．5、TBX5（GNT）及AF9，结合纳米转导技术高效转导到目的细胞BM－SCs细胞核内，检测细胞毒性，CPCs的生成效率，组蛋白H3K9乙酰化情况，ChIP－PCR技术检测H3K9ac的作用靶点。结果：心脏转录因子GNT联合AF9能提高BMSCs重编程生成CPCs的效率，在200μg／L／蛋白的工作浓度下，细胞生长良好，与GNT组相比，联合AF9组的H3K9ac表达明显增加，ChIP－PCR的结果显示H3K9ac富集在MEF2C的启动子区域。结论：心脏转录因子组合GNT联合表观遗传调控因子AF9通过纳米－蛋白转导方式，能高效重编程BMSCs得到CPCs，AF9通过上调H3K9ac来促进重编程过程。 -
Iloprost对DOX引起CPCs损伤的预防作用
目的 探讨iloprost对阿霉素(doxorubicin,DOX)处理的心脏祖细胞(cardiac progenitor cells,CPCs)的保护作用及其作用机制.方法 实验分为3组.对照组:CPCs给予DOX(1μmol/L)24h处理;CPCs给予DOX(1μmol/L)联合iloprost(1μmol/L)处理;CPCs给予DOX(1μmol/L)联合iloprost(1μmol/L)及CAY10441(1μmol/L)处理.分别通过MTT、apo-ONER homogeneous caspase-3/7、cAMP ELISA Kit 方法测定CPCs细胞的存活率、caspase-3/7激酶的活性以及CPCs细胞内cAMP水平.结果 与对照组相比,iloprost可以保护DOX对CPCs细胞的损伤作用,且iloprost受体抑制剂CAY10441可以明显降低该保护作用.iloprost可以明显抑制DOX对CPCs细胞内caspase-3/7的激活作用,且CAY10441可以逆转iloprost对DOX诱导的CPCs细胞内caspase-3/7激活的抑制作用.iloprost可以诱导CPCs细胞内cAMP的水平升高,而CAY10441同样可以逆转iloprost诱导的CPCs内cAMP水平的升高效应.结论 iloprost结合于其受体后可以增加CPCs细胞内cAMP的水平,从而发挥iloprost对DOX心肌细胞损伤的保护作用.本研究为iloprost作为DOX诱导CPCs损伤的保护剂提供了实验证据.
