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重组融合蛋白早期快速诊断侵袭性念珠菌病的实验研究
目的 建立一种IC早期快速准确的诊断方法.方法 178例临床需要送检侵袭性念珠菌病常规检测和真菌培养的患者血清为研究对象,其中103例确诊为侵袭性念珠菌病者作为病例组,75例为在同样免疫妥协易感人群但无念珠菌感染微生物学证据的患者血清作为对照组.应用基因重组的方法,将念珠菌菌丝壁蛋白(HWP1),与位于细胞壁的糖酵解酶(烯醇化酶蛋白ENO1)进行基因克隆,随后将由HWP1与ENO1组成的重组蛋白在大肠杆菌中表达,并建立酶联免疫方法(ELISA),检测患者血清中的IgG特异性抗体.通过统计学的分析,计算出该方法的灵敏度,特异性,阳性预测值,阴性预测值.筛选出灵敏度高,特异性强,阳性预测值和阴性预测值均高的融合蛋白抗原建立的ELISA方法.结果 病例组中抗-ENO1、抗-HWP1以及二者联合检测的阳性检出率均显著高于对照组(P＜0.01),差异有统计学意义.抗-HWP1与抗-ENO1两方法相比,抗-HWP1的敏感性(x2=37.622,P＜0.01)、阳预测值(x2=74.427,P＜0.01)及阴性预测值(x2=2.057,P=0.152)均显著高于抗-ENO1;联合检测与抗-ENO1比较,敏感性(x2=44.524,P＜0.01)、特异性(x2=9.765,P=0.002)及阳预测值(x2=72.000,P＜0.01)均显著高于抗-ENO1;联合检测与抗-HWP1相比,特异性(x2=4.700,P=0.030)、阴性预测值(x2=3.191,P=0.074)显著高于抗-HWP1.结论 ENO1和HWP1蛋白重组后联合诊断的效果更佳,可以作为IC早期快速准确的诊断方法.
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ENO1在胃癌干细胞中表达及其与胃癌侵袭转移的相关性研究
[目的]探讨ENO1在胃癌干细胞中的表达及其对胃癌侵袭转移的影响.[方法]以胃癌SNU-5模型,实时荧光定量PCR和双色细胞免疫荧光检测ENO1在其分选的CD44+细胞中的表达情况.运用慢病毒载体稳定干扰SUN-5中ENO1的表达,并用实时荧光定量PCR和Western blot检验干扰效率.流式细胞术分选稳定干扰ENO1的SNU-5中CD44+细胞后(shRNA-ENO1),实时荧光定量PCR检测其Oct-4、Sox 2以及干性相关基因Nanog的表达,同时分别进行细胞成球实验、体外侵袭与体内致瘤的胃癌干细胞生物学特性研究,Western blot检测ENO1对胃癌干细胞侵袭转移影响的相关分子机制.[结果]SNU-5的CD44+细胞中ENO1基因和蛋白表达明显高于CD44-细胞,并建立稳定干扰ENO1的SUN-5.shRNA-ENO1细胞中干性基因Oct-4、Sox 2和Nanog中mRNA的表达显著低于PLV-Ctr细胞(P＜0.05).与PLV-Ctr细胞相比较,shRNA-ENO1细胞的自我更新能力、侵袭能力和肿瘤重量显著降低.Western blot检测shRNA-ENO1细胞中Vimentin、Snail和N-cadherin下调表达,同时E-cadherin上调表达,并伴随AKT和PI3K的磷酸化水平降低,提示ENO1的作用可能通过PI3K/AKT信号通路激活.[结论]ENO1在胃癌干细胞中高表达,其在调控胃癌侵袭转移能力中发挥重要作用.
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干扰α烯醇化酶对耐药细胞株K562/A02耐药性的影响
目的：肿瘤耐药的产生是肿瘤治疗失败的主要原因之一,α烯醇化酶( eno1)与肿瘤细胞耐药产生和发展密切相关。探究eno1对人慢性粒细胞白血病耐药细胞株 K562/A02生长及耐药的影响。方法筛选3株稳定干扰eno1的细胞系K562/A02-sheno1和对照细胞系K562/A02-shcon；采用细胞计数法测定细胞生长速率, MTT法测定细胞增殖能力,细胞内罗丹明123含量测定细胞外排药物能力,real-time PCR反应测定基因mRNA表达水平, Western blot实验测定基因蛋白表达水平。结果与敏感性细胞株 K562相比, eno1在耐药细胞株K562/A02中为高表达状态,其在mRNA水平和蛋白水平表达分别增高(2．85±0．56)倍和(1．43±0．05)倍；而K562/A02细胞生长速率与K562细胞相比差异无显著性。 K562/A02-sheno1细胞系与对照组 K562/A02-shcon相比生长速率降低,对抗肿瘤药物紫杉醇和阿霉素的敏感性均增强,且K562/A02-sheno1细胞系中罗丹明123含量也明显增高。 K562/A02-sheno1细胞系中耐药相关基因MDR1表达水平降低。结论稳定干扰 eno1表达能抑制K562/A02细胞生长,有效逆转K562/A02细胞耐药性,提高其对药物的敏感性,其机制与MDR1基因表达相关。
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Sox2下游调控蛋白的筛选及其对大肠癌细胞增殖、迁移的影响
目的：分析大肠癌细胞转录因子Sox2对大肠癌细胞增殖及迁移的影响。方法应用SDS-PAGE蛋白电泳，结合考马斯亮蓝及镀胺银染色方法，筛选差异蛋白。质谱分析筛选Sox2下游调控蛋白，应用定量PCR（QPCR）及Western blotting验证和鉴定下游调控蛋白。Cell Counting Kit-8（CCK8）观察Sox2对大肠癌细胞增殖的影响，Transwell实验观察Sox2对迁移能力的影响。结果应用蛋白组学技术成功筛选出Sox2下调蛋白S3a、上调蛋白ENO1、Gama-actin。QPCR和Western blotting显示，Sox2过表达后，大肠癌细胞S3a表达减少（P<0.005），ENO1表达增加（P<0.05），Gama-actin表达无明显差异，细胞增殖及迁移能力提高（P<0.05）；Sox2干扰后，大肠癌细胞S3a表达增加（P<0.05），ENO1表达减少（P<0.001），Gama-actin表达无明显差异，细胞增殖及迁移能力下降（P<0.05）。结论 Sox2负向调控S3a的表达，正向调控ENO1的表达，促进大肠癌细胞增殖及迁移。
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烯醇化酶ENO1抑制非小细胞肺癌细胞上皮间质转换
背景与目的 已有的研究表明:上皮间质转换(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是非小细胞肺癌发展和转移的一个重要过程,受到众多信号通路的精细调节.经典的丝裂原活化激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)信号通路是转化生长因子(transforming growth factor β,TGFβ)诱导EMT发生的必要条件.本研究以非小细胞肺癌细胞系A549为模型,对烯醇化酶(enolase-1,ENOI)影响细胞EMT过程的分子机制进行了初步研究.方法 建立稳定过表达ENOl的A549细胞,用划痕实验检测细胞运动能力；用Western blot技术检测EMT过程相关分子标志物的变化；通过TGFβ-1诱导实验检测ENO1过表达对EMT的影响；通过上皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)诱导实验和Western blot检测ENO1过表达引起胞外信号调节激酶(extracellular signal regulated protein kinase,ERK)磷酸化的改变.结果 ENO1过表达抑制A549细胞侧向迁移能力.ENO1过表达还会引起上皮样标志物E-cadherin表达上调,同时间质样标志物N-cadherin和Vimentin表达下降；TGFβ-1诱导实验也证实了ENO1对EMT进程的抑制作用.EGF活化实验显示ENO1对ERK磷酸化的抑制作用.结论 在非小细胞肺癌细胞中,ENO1具有抑制细胞EMT的作用,且很可能是通过抑制MAPK通路来实现.
