甲型 H1N1流感疫苗神经氨酸酶含量测定参考品的建立

目的：建立甲型 H1N1流感疫苗神经氨酸酶含量测定参考品。方法对甲型 H1N1流感疫苗原液进行还原电泳后，采用免疫印迹，糖蛋白染色，方法初步确定甲流 H1N1疫苗原液中神经氨酸酶 SDS-PAGE 条带位置，切取条带后通过 edman N 端测序法进行确认。采用 Lowry 法进行总蛋白定量，SDS-PAGE 密度扫描的方法确定神经氨酸酶比例，计算出疫苗原液中神经氨酸酶含量。结果确定甲流疫苗原液中神经氨酸酶在 SDS-PAGE 中相对分子质量约71000，对多批次疫苗原液进行测定后，选取神经氨酸酶含量较高的批次进行测定，总蛋白质量浓度为1046．00μg／mL，神经氨酸酶质量分数11．78％。二者相乘得出该批次疫苗原液神经氨酸酶含量为123．22μg／mL。结论研究成功建立了甲型 H1N1流感疫苗神经氨酸酶含量测定参考品，其他毒株生产的流感疫苗也可以参考该方法建立 NA 含量测定参考品。

神经氨酸酶预处理供体骨髓细胞延长大鼠异体移植物成活时间的观察

目的筛选神经氨酸酶(Neu)预处理供体骨髓细胞(dBMCs)的佳浓度,使经大鼠尾静脉注射该浓度Neu后的dBMCs偏向性分布于受体肝脏,并观察Neu预处理dBMCs(Neu-dBMCs)联合环孢素A(CsA)短期应用对异体皮片成活时间的影响.方法供体为雄性SD大鼠49只,受体为雌性Wistar大鼠49只.常规制备dBMCs并留取供体皮片备用.Neu预处理浓度筛选实验:按Neu终浓度将26只受体大鼠随机分为0、0.5、1.0、2.0 U/ml 4组(各组分别为6、8、6、6只),用上述4种浓度Neu预处理dBMCs,以99mTc-SnCl2法标记,再经受体尾静脉注入,5 h后取受体各主要器官,测定其放射性活度,计算出各器官的放射性活度占全部所测器官总放射性活度的百分比,筛选出使dBMCs偏向性分布于受体肝脏的佳Neu预处理浓度.异体皮片移植实验:将余下23只受体大鼠随机分为对照组、dBMCs组和Neu-dBMCs组,每组均行异体皮片移植,其中后两组在手术当天经尾静脉分别输注dBMCs和Neu-dBMCs(Neu为筛选出的佳浓度),并分别于术后第2、5天腹腔注射CsA(10 mg/kg),观察各组异体皮片的成活情况.结果在Neu预处理浓度为1.0 U/ml时,受体肝脏内dBMCs呈偏向性分布,其百分比为(75.3±9.8)%,明显高于其他浓度组,与0 U/ml组[(58.9±4.2)%]比较差异有统计学意义(P＜0.01).1.0 U/ml为Neu的佳浓度.Neu-dBMCs组的同种异体皮片成活时间较dBMCs组明显延长,两组比较差异有统计学意义(P＜0.05).这两组异体皮片成活时间均较对照组明显延长(P＜0.01).结论适当浓度的Neu预处理可增强dBMCs与肝脏的亲和性,使经外周静脉输注的dBMCs偏向性分布于受体肝脏内.Neu-dBMCs短期联合应用CsA可明显延长移植的供体皮片成活时间.

甲型H1N1流感重组病毒模型的建立及应用

目的:针对流感病毒感染宿主机体的作用机制,建立以甲型H1N1流感A/California/04/2009(H1N1)为靶点的重组病毒模型,并对其应用进行探索.方法:通过将表达流感病毒血凝素蛋白HA、神经氨酸酶NA及敲除外壳基因、复制基因并带有荧光素酶报告基因的HIV-1质粒共转染至293T包装细胞,产生以HA[A/California/04/2009(H1N1)]和NA[A/California/04/2009(H1N1)]为膜蛋白,HIV-1(pNL4-3.Luc.R-E-)为核心的重组病毒.通过该重组流感病毒模型评价阳性对照化合物(奥斯他韦、奥斯他韦酸)、中和血清以及板蓝根药材提取液对重组病毒活性的抑制作用.结果:奥司他韦、奥司他韦酸抑制重组病毒pNL+HA04+NA04的IC50为1.07×10-8 mol· L-1和1.82×10-9 mol·L-1;中和血清的IC50为1∶320～1∶640;中药板蓝根提取液的IC50为1.91×10-5g·mL-1.结论:奥斯他韦、奥斯他韦酸、中和血清及板蓝根提取液对于重组病毒的活性有抑制作用,提示所构建的重组病毒模型可用于上述作用机制药物的筛选和评价.

抗流感病毒临床药物的进展

2017年长沙地区两株新型H7N9禽流感病毒血凝素和神经氨酸酶基因特征分析

目的 从分子水平对长沙市新型H7N9禽流感病毒株进行基因特征分析,揭示禽流感病毒的变异情况.方法 2株毒株经逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcript-polymerase chain reaction,RT-PCR)方法扩增血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因片段,进化树分析氨基酸关键位点.结果 氨基酸分析显示2株毒株(A/Changsha/26/2017和A/Changsha/41/2017)受体结合位点为G195V和Q235L.多个氨基酸位点发生新的突变,包括A130T、S136N、R148K和M245I (Ⅴ).NA基因中耐药性位点K294R,未发生变异.进化树研究表明,HA基因与2017年广东省分离的3株毒株共为一个分支,并单独分为一个亚支.NA基因遗传距离近的是A/Chicken/Ganzhou/GZ79/2016.结论 长沙市出现的H7N9禽流感病毒株已进化为一个单独分支,为高毒力新型H7N9病毒株,需加强禽流感病毒的防控力度,预防人群的感染.