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禽流感病毒
一、禽流感流感病毒依其内部核蛋白(NP)和基质蛋白(M1)抗原性,分作甲(A)、乙(B)、丙(C)3型,禽流感(avian influenza)乃系甲型流感病毒感染而引起禽类发病的统称.甲型流感病毒又因其表面蛋白红细胞凝集素(HA)和神经氨酸酶(NA)的抗原性可区分亚型(H1～H15和N1～N9)(图1),例如有H1N2组合而成的亚型.
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流感疫苗研究进展
流感病毒属于正粘液病毒科(orthomyxoviridae),病毒颗粒呈球形或多形态.病毒颗粒结构分为3层,外层为来自宿主细胞的双层类脂囊膜,中间层为球形蛋白壳,里层为裹在蛋白壳内的核壳体,含有核蛋白(NP)、三种多聚酶蛋白(PB1、PB2、PA)和病毒单链的RNA.囊膜上覆盖着由血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)和M2蛋白构成的突起.M2是抗病毒药金刚烷胺和金刚乙胺的靶.病毒基因为分节段的单负链RNA.根据其各自核蛋白(NP)和膜蛋白(MP)抗原差异,流感病毒分为甲(A)、乙(B)、丙(C)3型.HA和NA抗原分别使病毒附着细胞和穿入细胞,并使子代病毒从感染细胞中释放出来,而且还决定甲型流感病毒的亚型.至今甲型流感病毒已发现15个亚型,9个N亚型.这些病毒的节段性单链RNA基因组至少编码10种蛋白.
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H7 N9流感病毒HA、NA蛋白的抗原表位预测及其与HLA－Ⅱ类等位基因的相关性分析
目的：分析H7N9流感病毒的HA、NA蛋白的抗原表位；预测H7N9流感病毒相关的HLA－Ⅱ类等位基因及易感人群。方法：软件分析HA、NA的同源性、B细胞表位、T细胞表位以及与HA、NA结合力强的HLA－Ⅱ类等位基因；并根据该等位基因在亚洲不同地域的基因频率，预测H7N9的易感人群。结果：H7N9流感病毒株之间氨基酸序列相对保守；HA具有10个B细胞表位和15个T细胞表位；NA有12个B细胞表位和9个T细胞表位；HLA等位基因DRB1*0701与HA、NA具有强结合力，在新疆、哈尔滨、山东、辽宁、北京、石家庄、天津等多个中国北方地区人群中的基因频率较高，高于广东、云南、台湾地区、日本和韩国。结论：预测了HA、NA的抗原性表位，为H7 N9流感病毒的疫苗研究提供了理论基础；HLA－DRB1*0701与H7 N9流感病毒高度相关；H7 N9流感病毒在新疆、哈尔滨、山东、辽宁、北京、石家庄、天津地区更易传播。
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高致病性禽流感的流行及其预防控制
禽流行性感冒(简称禽流感,Avian influenza,AI)也称禽流感综合征,是由A型流感病毒(Avian influenza virus,AIV)引起的急性、高度致死性、烈性传染病.该病已被列入国际生物武器公约动物类传染病名单.AIV依据其外膜血凝素(Hemagglutinin,H)和神经氨酸酶(Neuraminidase,N)抗原性的不同,目前至少可分为15个H亚型(H1～H15)和9个N亚型(N1～N9).由H5和H7亚型毒株(以H5N1和H7N7为代表)所引起的禽类疾病称为高致病性禽流感(Highly pathogenic avian influenza,HPAI),其发病率和病死率都很高,危害极大[1,2].自1997年报道禽类H5N1亚型流感病毒感染人类以来,相继有H9N2、H7N7亚型感染人类和H5N1再次感染人类的报道,引起了世人的广泛关注[1],AIV威胁着人类和动物的健康.
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禽流感病毒的变异进化及其预防控制
流感病毒属于正粘病毒科,为有包膜单链负股RNA病毒,其基因组由7或8个基因片段组成.流感病毒包膜上有两种重要的表面蛋白,血凝素(Hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(Neuramidinase,NA),尤其是HA分子,除了能够和宿主细胞表面的HA受体特异性结合、介导病毒包膜与宿主细胞膜的融合外,也是机体免疫系统识别和攻击的主要靶点[1].
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芦丁与奥司他韦联合对H1N1流感病毒神经氨酸酶的抑制作用
目的 探究芦丁与奥司他韦联合对H1N1流感病毒神经氨酸酶(N1)的抑制作用.方法 首先分别测定芦丁与奥司他韦对N1抑制的IC50值,而后根据芦丁与奥司他韦各自对N1的抑制活性选取浓度分别为其0.5,1,2,4倍IC50的浓度倍数,保证加入芦丁奥司他韦的浓度的比例保持一致.后测定二者联合使用对N1的抑制作用.结果 芦丁与奥司他韦联合药物指数(CI)均小于1.结论 芦丁与奥司他韦联合用药对H1N1流感病毒神经氨酸酶是协同抑制作用.
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电泳法测定碱性磷酸酶同工酶的临床意义
目的探讨碱性磷酸酶同工酶测定的临床意义.方法用神经氨酸酶孵育血清快速电泳法检测181例血清ALP同工酶.结果健康成人ALP同工酶电泳主要为肝型和骨型,其所占比例分别为34.5%～62.3%和37.7%～65.5%.男女性别之间ALP无明显差异(P＞0.05).儿童ALP同工酶主要为骨型ALP,占85%以上.肝、骨ALP分离彻底,区带清晰.肝病:主要为肝型ALP,达80%以上;骨病:主要为骨型ALP,达80%以上;阻塞性黄疸:为肝型和骨型ALP活性均增高,但以肝型ALP增高更为突出;佝偻病:为骨型ALP轻、中度升高,不超过总活性的70%;孕妇:在肝和骨之间出现胎盘型ALP峰.结论测定ALP总活性及其同工酶对引起ALP活性增高疾病的诊断和鉴别诊断有重要的临床意义.
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表达甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶的重组腺病毒的构建及其免疫原性
目的 构建表达甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)的重组腺病毒,并检测其免疫原性.方法 从质粒pMD19T-simple-NA中扩增NA基因,克隆至穿梭质粒pShuttleCMV中,经同源重组获得重组腺病毒质粒,转染Ad-293细胞,包装出重组腺病毒Ad-NA,RT-PCR和免疫荧光法检测NA基因在Vero细胞中的转录和表达.CsCl密度梯度离心纯化重组腺病毒,免疫小鼠,ELISA法检测免疫小鼠血清中抗NA抗体滴度.结果 重组腺病毒质粒经Pac Ⅰ酶切鉴定表明带有目的基因的穿梭质粒已整合到腺病毒基因组中；NA基因在Vero细胞中成功转录和表达；重组腺病毒可刺激小鼠产生抗NA抗体,初免后4周,抗体水平达高,为1∶100000.结论 成功构建了表达甲型H1N1流感病毒NA蛋白的重组腺病毒,其可刺激小鼠产生有效的免疫应答,为甲型H1N1流感病毒基因工程疫苗的研发奠定了基础.
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影响禽流感病毒(H3N2/H4N6)感染机制的生物信息学分析
目的 通过生物信息学分析禽流感病毒WDK/ST/27 /03(H3N2)和Dk/ST/472/03 (H4N6) HA、NA氨基酸序列,进一步探讨影响禽流感病毒感染血液肿瘤细胞株K-562和HL-60的机制.方法 RT-PCR扩增WDK/ST/27/03 (H3N2)和Dk/ST/472/03 (H4N6) HA、NA基因,经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定,对纯化的PCR产物进行测序.在GenBank中选取登录的H3N2和H4N6序列,利用在线生物信息工具ClustalW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)对这些序列和WDK/ST/27/03 (H3N2)和Dk/ST/472/03 (H4N6) HA、NA氨基酸序列进行比对分析.结果 RT-PCR扩增产物的大小与预期相符.生物信息学分析显示,WDK/ST/27/03(H3N2) HA的裂解位点是QNR*GLFG,Dk/ST/472/03 (H4N6) HA的裂解位点是KAAR*GLFG,此位置的氨基酸无变化.HA的226位氨基酸为Gln(Q),228位氨基酸为Gly(G),具有禽流感病毒HA受体结合位点的特征,影响受体结合的位点98Y、136S、152W、183H,190E、194L、222W、225G、227S未见变异.NA活性位点及影响酶活的位点均无变异,但WDK/ST/27/03(H3N2) NA在接近N-末端的茎部61～79位缺失19个氨基酸,致使NA茎部变短,且丢失2个潜在的糖基化位点.结论 WDK/ST/27/03(H3N2)的NA茎部缺失突变可能是造成其吸附、繁殖和复制能力低于Dk/ST/472/03 (H4N6)的一个因素.
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流感疫苗株H3N2(NYMCX-223A)主要抗原基因特征与传代稳定性
目的 分析2013年流感疫苗生产用甲型H3N2(NYMCX-223A)毒株主要抗原血凝素(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(neuraminidase,NA)基因特征,并检测该疫苗株主种子批、工作种子批及疫苗病毒收获液的传代稳定性.方法 对制备的H3N2疫苗株的主种子批、工作种子批及疫苗病毒收获液进行全面的生物学特性检测;采用RT-PCR法从主种子批、工作种子批及疫苗病毒收获液中扩增HA及NA基因片段,并进行全基因序列测定及分析;应用MEGA 5.05软件对7株不同年份的H3N2亚型疫苗株的HA氨基酸序列进行比对,绘制基因种系发生树.结果 H3N2疫苗株的主种子批、工作种子批抗原性与2013年度WHO推荐毒株相一致,其他生物学特性均符合《中国药典》三部(2010版)标准;主要抗原HA基因序列长度为1 701 bp,编码566个氨基酸;NA基因序列长度为1 410 bp,编码469个氨基酸,各代次流感病毒HA和NA基因核苷酸和氨基酸序列均一致,与GenBank公布的序列完全一致,同源性为100％.2013年与2012年H3N2疫苗株HA氨基酸序列相比,同源性为97.5％.2013年与2012年H3N2疫苗株具有较远的进化距离,与同源性结果相对应.结论 2013年甲型H3N2(NYMCX-223A)流感疫苗株主要抗原基因传代稳定,一般生物学特性符合《中国药典》三部(2010版)要求.2013年与2012年H3N2疫苗株序列差异较大.
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甲型H1N1流感重症患者病毒血凝素和神经氨酸酶基因特性分析
目的 通过分析2009-11-02～12-04期间北京市6例甲型H1N1流感重症患者咽拭子中病毒的血凝素、神经氨酸酶基因特性,了解其基因进化特点,以期对下一步甲型H1N1流感的防控和重症的治疗提供理论依据.方法 使用实时荧光PCR方法,检测重症患者样本为甲型H1N1流感病毒阳性样本,利用测序引物扩增血凝素、神经氨酸酶基因,测定核苷酸序列,利用生物信息软件拼接序列;分析重要基因位点,对其进行基因进化、耐药性分析.结果 6件测定样本血凝素、神经氨酸酶基因与疫苗株A/California/07/2009(H1N1)核苷酸、氨基酸的同源性分别为99.2%及99.5%,有8个血凝素基因的氨基酸发生替换,为65、100、145、185、216、220、338及391位,其中145位位于抗原决定簇A区,220位位于抗原决定簇D区,同时是受体结合位点的后壁;有5个神经氨酸酶基因的氨基酸发生了替换,为59、106、232、248及365位,其中106、232、248位位于酶活性区域;未发生神经氨酸酶基因275位H→Y的替换.结论 北京市甲型H1N1流感重症患者病毒血凝素和神经氨酸酶基因与疫苗株A/California/07/2009(H1N1)高度同源,部分血凝素基因、神经氨酸酶基因有氨基酸替换,但其作用不清.所有测定样本未发生对达菲类药物的耐药性突变.
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上海市闵行区禽类接触人群甲型流感病毒抗体调查
甲型流感是由甲型流感病毒引起的人和动物共患的一种呼吸道传染病,传染性强,传播途径易实现,病原体常变异导致难以有效控制.甲型流感病毒有多种亚型,已证实有15种血凝素(H1～H15)和9种神经氨酸酶(N1～N9).目前人群中流行主要为H1和H3型,其中H3型居多;而在禽类特别是水禽中各个亚型的血凝素均已被发现[1～3].1997年香港的H5N1、2003年底至2004年初亚洲地区H5N1以及1998年至1999年我国内地和香港H9N2禽流感病毒人间感染事件的发生,都昭示了人感染禽流感病毒的高度可能性.
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黄连-厚朴药对9个配伍比例对抑制神经氨酸酶活性的影响
目的 探索黄连-厚朴药对9个配伍比例(0∶1、1∶5、2∶5、2∶3、1∶1、3∶2、5∶2、5∶1、1∶0)对抑制神经氨酸酶活性的影响.方法 底物荧光检测法测定不同配伍比例药对对神经氨酸酶的抑制活性,非线性回归法确定量效曲线参数,建立三维响应曲面模型,响应面法分析配伍比例与抑制作用的关系.结果 各配伍比例药对对神经氨酸酶均有抑制活性,在1∶1时作用强.配伍比例在0.55∶1～1.11∶1时,药对表现出明显的协同作用(作用强度-0.800),而其他配伍比例下协同作用较弱,或产生相加甚至拮抗作用.结论 该方法可为黄连-厚朴药对治疗流感时配伍比例的选择提供依据.
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副粘病毒血凝素-神经氨酸酶蛋白结构与功能的研究进展
副粘病毒的血凝素-神经氨酸酶和融合蛋白具有重要的生物学活性,其中前者具有受体识别活性、神经氨酸酶活性和促进融合蛋白的细胞融合作用.本文对近年来血凝素-神经氨酸酶结构和功能方面的研究进展进行了综述.
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禽流感病毒与人禽流感的研究进展
禽流感病毒(AIV)与甲型流感病毒同属正黏病毒科(Orthonuxoviridae).迄今根据血凝素H,共有16个亚型,神经氨酸酶N共有9个亚型,可组成144种亚型.虽然H1～16均存在于禽中,但迄今已报道可直接感染人的AIV为H5、H7、H9及H10.其中1997年香港特区流行的亚型是H5N1,有18例患者,6例死亡.1999、2000、2004年在中国内地及香港特区感染人的AIV主要是H9N2亚型.有报道,H7N2、H7N3、H7N7、H10N7亚型分别曾在荷兰、美国、加拿大、埃及感染人,但病例数少,且未有患者死亡.
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基于神经氨酸酶的流感疫苗研究进展
当前广泛使用的季节性流感疫苗的主要抗原成分包括2个重要的流感病毒表面糖蛋白,血凝素和神经氨酸酶(neuraminidase,NA).研究表明NA抑制性抗体虽然不能防止流感病毒感染,但能有效抑制病毒扩散,因此基于NA设计的疫苗开始受到重视.NA的相对保守性也使此类疫苗有潜力成为广谱流感疫苗.目前基于NA的多种形式流感疫苗,包括DNA疫苗、病毒样颗粒疫苗、重组载体疫苗、重组亚单位疫苗以及联合其他流感病毒蛋白的疫苗等,在动物模型中均表现出诱导交叉保护的能力.此文综述了近年来发表的有关基于NA的流感病毒疫苗的研究.
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乙型流感疫苗生产用毒株NYMC BX-51B主要抗原的基因特征及传代稳定性研究
目的 了解2013年流感疫苗生产用乙型病毒株NYMC BX-51B主要抗原血凝素(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(neuraminidase,NA)的基因特征,并研究该疫苗株的传代稳定性.方法 对制备的乙型流感病毒株主种子批、工作种子批及收获液病毒进行全面的生物学特性检定.采用逆转录-PCR法从主种子批、工作种子批及疫苗病毒收获液中扩增HA及NA基因片段,并进行全基因序列测定及分析.对7株不同年份的乙型疫苗株及野毒株的HA氨基酸序列进行比对,绘制氨基酸种系发生树.结果 该毒株主种子批和工作种子批的抗原性与WHO2013年推荐的毒株一致,种子批和收获液病毒的生物学特性均符合我国2010年版药典标准.HA基因序列长度为1 755 bp,编码584个氨基酸;NA基因序列长度为1 401 bp,编码466个氨基酸.各代次流感病毒HA和NA的基因核苷酸和氨基酸序列均相同,与GenBank发布的序列完全一致,同源性为100％.2013年乙型疫苗株的HA氨基酸序列与2010和2012年相比,同源性分别为94.3％和98.4％.结论 2013年乙型流感疫苗株NYMCBX-51B主要抗原基因传代稳定,一般生物学特性符合我国药典要求.2013年疫苗株的HA氨基酸序列与2010年相比进化距离较远.
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流感DNA疫苗免疫BALB/c小鼠克服母源性抗体干扰的研究
目的 为了克服母源性抗体对子代的免疫抑制作用,寻找避免母源性抗体干扰的流感疫苗免疫策略.方法 以小鼠为动物模型,接种流感灭活疫苗或DNA疫苗,并用致死量流感病毒感染.感染后检测小鼠的存活率、肺部病毒滴度、体内抗体滴度等指标,对疫苗的保护效果进行评价.结果 母代与子代免疫相同的疫苗,不论是灭活疫苗还是DNA疫苗,子代体内的母源性抗体都抑制了子代免疫后的自动免疫应答,表现为子鼠接种疫苗后不能抵御致死量流感病毒感染;母代免疫流感灭活疫苗,子代免疫神经氨酸酶DNA疫苗,子鼠能够克服母源性抗体干扰,抵御致死量流感病毒感染;母代和子代免疫不同的DNA疫苗,即母代免疫血凝素或神经氨酸酶DNA疫苗,子代免疫神经氨酸酶或血凝素DNA疫苗,也能达到克服母源性抗体干扰的目的 .结论 流感DNA疫苗免疫BALB/c小鼠能克服母源性抗体的干扰,这为临床新生儿抗母源性抗体干扰的研究提供了实验参考.
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H9N2禽流感病毒血凝素和神经氨酸酶DNA疫苗对小鼠的免疫保护研究
目的 检测H9N2禽流感病毒血凝素(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(neuraminidase,NA)DNA疫苗保护小鼠抵抗致死量同源病毒感染的能力.方法 通过小鼠肺对肺传代,建立禽流感病毒A/chicken/Jiangsu/07/2002(H9N2)小鼠适应株.同时,构建病毒HA和NA DNA疫苗,以不同剂量电击法免疫小鼠1或2次,在初次免疫后4周或加强免疫后1周用致死量(40 LD50)鼠适应型病毒攻击小鼠.通过测定小鼠血清抗体滴度、小鼠存活率和肺部病毒滴度来评价疫占的效果.结果 HA或NADNA 10μg免疫1次或3μg免疫2次均可保护小鼠抵抗致死昔H9N2病毒的感染.结论 低剂量HA或NA DNA可为抗H9N2禽流感病毒感染提供有效的免疫保护.
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2010年广州市甲型H1 N1流感病毒分离株NA基因变异分析
目的：比较2010年从广州市分离到的甲型H1 N1流感病毒神经氨酸酶（NA）基因与2009年中国大陆甲型H1 N1流感病毒NA基因的变异情况，为甲型H1 N1流感的监测和防控提供参考资料。方法收集2010年广州市有发热和呼吸道症状患者的咽拭子标本，用甲型H1 N1流感病毒特异性引物进行聚合酶链反应（PCR）检测，扩增分离到的甲型H1 N1流感病毒NA基因片段，测序后与2009年的H1 N1毒株进行比对和进化分析，并用生物信息学方法对耐药位点和糖基化位点进行分析。结果共收集1194份咽拭子标本，检测到甲型流感病毒阳性327份，其中H1 N1流感病毒6株，与2009年分离的甲型H1 N1流感病毒相比，有16个位点发生了有义突变，3个位点和NA活性相关，其中222位氨基酸的变异位于NA活性位点上。结论成功扩增了2010年广州市6株甲型H1 N1流感病毒株NA基因并测序，未发现H275 Y耐药位点的变异。3毒株在NA活性位点222位、228位和425位等氨基酸位点处发生了变异，需继续加强监测。
关键词： 甲型H1 N1 流感病毒 神经氨酸酶 耐药位点
