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我国H7N9禽流感病毒血凝素和神经氨酸酶基因的分子进化分析
目的 探讨我国H7N9禽流感病毒血凝素和神经氨酸酶基因的分子进化情况.方法 通过2013年1月～2015年11月不同途径公布的人感染H7N9禽流感病例资料,分析我国H7N9禽流感病毒流行病学特点,筛选H7N9禽流感病毒株的核酸序列和氨基酸序列,分析核苷酸及所编码关键位点情况.结果 国内病毒株同源性得分＞0.99,从神经氨酸酶基因同源性分析中,广东第1例H7N9禽流感的神经氨酸酶基因KF662949和山东的H7N9禽流感的神经氨酸酶基因CY147110、浙江的H7N9禽流感的神经氨酸酶基因KF500926具有较高的同源性,其中KF662949和CY147110同源性得分达到0.999.血凝素氨基酸序列裂解位点和潜在糖基化位点分别为30、46、249、421、493,神经氨酸酶氨基酸序列耐药位点和潜在的糖基化位点主要包括神经氨酸酶119R、120E、152D、153R、200N、226R、229E、245D、276H、278E、279E、294R、332D、351K、427E.结论 H7N9禽流感毒株在时间和空间方面有一定的聚集性,时间越近、空间距离越短,可能出现进化关系越发接近.
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解脲脲原体、人型支原体快速、简便的耐药性监测
目前,泌尿生殖道Uu(解脲脲原体)、Mh(人型支原体)感染的常规治疗受到普遍重视,Uu可通过胎盘感染胎儿,引起自发性流产,并可吸附于精子表面,产生神经氨酸酶样物质,阻碍精子运动,干扰精子与卵子结合,引起不育症.对免疫缺陷个体的研究发现Uu与类风湿性关节炎、性传播性疾病的反应性关节炎和人类其他关节炎组织损伤的关系不容忽视.
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流感的生物预防——疫苗接种
揭开流感的面纱流行性感冒(简称流感)是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病.流感病毒为RNA病毒.病毒颗粒由三层结构组成,外层为两种突起的表面抗原,一种是血凝素(HA),另一种是神经氨酸酶(NA),蹭层是类脂体和核蛋白(NP)和三个多聚酶蛋白缠绕在一起.
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禽流感病毒H5N1血凝素基因和神经氨酸酶基因在真核酵母菌中的表达
目的 克隆、表达和鉴定禽流感病毒H5N1血凝素基因(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶基因(neuramidinase,NA)序列,为制备抗体和基因工程疫苗打下基础.方法在成功克隆禽流感病毒H5N1全长HA、NA基因并测序的基础上,将部分基因序列克隆到表达载体pMET A上,构建了重组表达质粒pMET A/HA(49～1 587 bp)、pMET A/NA(121～1 200bp),电转化真核酵母菌pMAD16,甲醇诱导表达,利用Ni2+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,并用Western Blotting和ELISA方法检测其抗原性.结果重组蛋白在酵母菌中可以高效表达,SDS-PAGE显示蛋白表达后形成了二聚体,蛋白纯度占总蛋白的95％以上,EUSA和Western Blotting实验证实,重组蛋白具有良好的抗原性.结论本研究成功克隆和表达了禽流感病毒H5N1 HA、NA基因序列,为禽流感病毒H5N1诊断试剂和疫苗的开发等进一步的研究提供了依据.
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甲型H7N9流感病毒血凝素和神经氨酸酶的进化及抗原位点变异分析
目的 分析甲型H7 N9流感病毒的血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)进化及其抗原位点变异.方法 从美国国立生物技术信息中心(NCBI)和全球共享禽流感数据倡议组织(GISAID)数据库检索并下载从建库到2013年4月13日的H7N9病毒HA、NA的基因和氨基酸序列.应用Clustal-W、MEGA 5.0、NetNGlyc 1.0 Server、DNAMAN等生物信息学软件,对HA、NA的基因序列和氨基酸序列进行比对分析以及预测其潜在的抗原位点.结果 共有26条HA基因和氨基酸序列以及24条NA基因和氨基酸序列纳入分析.美洲地区的H7N9流感病毒HA、NA基因和氨基酸的保守性较亚欧地区高.HA、NA基因进化分为亚欧地区和美洲地区两大系.所有病毒HA裂解位点附近仅含1个碱性氨基酸R(Arg).HA蛋白裂解位点和NA蛋白糖基化位点表现出地区差异,HA蛋白糖基化位点保守.HA、NA蛋白在亚欧地区和美洲地区有多个抗原位点发生变异.7例中国分离的新型H7N9病毒进化位于亚欧地区分支,NA的茎部在69～ 73位有5个氨基酸缺失,HA蛋白裂解位点、糖基化位点未发生变异,HA、NA蛋白多个抗原位点发生了与其他病毒株不同的变异.结论 H7N9病毒HA、NA进化表现出地区差异性.NA茎部氨基酸的缺失和HA、NA蛋白多个抗原位点的变异可能与人感染H7N9流感爆发有关.
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引发流感病毒对奥斯他韦等抗流感药物耐药的因素以及监测和预防耐药性的方法研究进展
1 流行性感冒病毒流行性感冒简称流感,是由黏液病毒科的RNA流行性感冒病毒引起的一种以急性呼吸道感染为特征的传染病.流感每年在温带的秋冬季节大量流行,与病毒有关的严重并发症导致了在危重患者中有较高的死亡率.黏液病毒科下分5个属,包括甲型(A)流感病毒属、乙型(B)流感病毒属、丙型(C)流感病毒属,传染性鲑鱼贫血病毒属(Isavirus)和托高土病毒属(Thogotovirus).甲型流感病毒以病毒表面突起的两种蛋白质即血凝素(hemagghtinin)和神经氨酸酶(neuraminidase)来区分.甲型病毒共有16种不同的血凝素以及9种不同的神经氨酸酶,命名上便以H1N1,H2N2依此类推来命名.目前仅确定H1N1、H2N2、H3N2这3种会感染人类.
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绵马贯众中间苯三酚类化合物抗流感病毒的活性筛选
目的 基于绵马贯众中间苯三酚类成分寻找具有良好抗流感病毒活性的化合物.方法 将25个绵马贯众中间苯三酚类化合物与12种流感病毒神经氨酸酶(neuraminidase,NA)进行分子对接,通过评价结合能、结合模式及发生相互作用的重要氨基酸等指标进行虚拟筛选.通过神经氨酸酶抑制实验验证其中4个候选化合物体外抑制NA的活性,在此基础上,采用犬肾MDCK细胞通过细胞病变(CPE)法对候选化合物M22的抗病毒活性进行进一步的验证.结果 通过分子对接筛选出5个与NA有较好结合能力的候选化合物;NA抑制实验结果表明候选化合物中M22对NA抑制作用显著;CPE实验结果表明M22对多种流感病毒毒株均具有较好的抑制作用.结论 绵马贯众中候选化合物M22具有较好的抗流感病毒作用,为开发新的抗流感病毒药物的深入研究奠定了基础.
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板蓝根化学成分与抗流感病毒神经氨酸酶活性相关性的探讨
目的 探讨板蓝根化学成分与体外抗流感病毒神经氨酸酶(NA)活性的相关性.方法 采用UPLC法建立不同产地板蓝根提取液的指纹图谱,并选取已知共有峰进行定量测定,采用试剂盒法测定药物抑制流感病毒NA活性,对化学信息和生物效应进行灰色关联分析和单因素相关分析,以探索其相关性.结果 不同产地药材、不同提取方法得到的样品的化学成分量与生物效应均有一定的差异.UPLC指纹图谱各共有峰中已知峰(R,S)-告依春和尿苷与抑制流感病毒NA活性相关性较强,其中(R,S)-告依春量与生物效应显著相关.结论 基于NA活性检测结果,初步明确了板蓝根化学成分量与生物效应的相关性,为板蓝根抗病毒有效成分的筛选和提取提供数据参考.
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热毒宁注射液及其组分对流感病毒神经氨酸酶的抑制作用研究
目的 研究热毒宁注射液及其组分对流感病毒神经氨酸酶(NA)抑制活性.方法 通过测定流感病毒NA的荧光强度值来确定热毒宁注射液及其组分对流感病毒NA的抑制活性.结果 热毒宁注射液对H1N1、H3N2、B流感病毒NA抑制活性较高,半数抑制浓度(IC50)分别为(46.49±2.25)、(49.77±1.77)、(45.33±5.32) μg/mL.金银花聚酰胺柱洗脱浓缩液、醋酸乙酯萃取液及残液、柱色谱提取物、隐绿原酸、异绿原酸A和异绿原酸B对H1N1、H3N2、B流感病毒NA酶活性均具有抑制作用.结论 热毒宁注射液及其有机酸类成分对流感病毒神经氨酸酶活性均具有一定抑制作用.
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基于神经氨酸酶结构的流感病毒抑制剂的计算机辅助药物设计
目的:虚拟筛选更高活性的神经氨酸酶(NA)抑制剂,提高抵抗变异病毒的能力,为以后相关疾病治疗新药的设计提供科学依据.方法:利用Schrodinger Suite2009中的Glide模块对Leadnow数据库进行高通量虚拟筛选,对选出的结构用“Core Hopping”模块改造结构;利用Desmond2.4软件包进行分子动力学模拟研究,将NA的空载蛋白及靶点与筛选结果较好的配体小分子复合物共3个模型分别进行10 ns的分子动力学模拟.结果:高通量虚拟筛选得到一个五元环结构的化合物ZINC 13219479,并以此为核心向150-cavity延伸,得到8个能很好进入的结构.建立了靶向这些位点的配体库,方便后续有关研究的进行.分子动力学结果表明模拟过程中各靶点与配体复合物体系稳定,结合位点正确.作为抑制剂,小分子配体与NA酶的150-cavity区域残基形成稳定的氢键作用,牢牢占据NA的催化位点.结论:通过计算机辅助设计得到的小分子与NA的结合能力理论上优于抑制剂达菲.在动力学模拟这些化合物后,更加确定了这些化合物的有效性,具有一定的科研价值.
关键词： 神经氨酸酶 流感病毒 计算机辅助药物设计 达菲 150-cavity -
H274Y突变型H5N1流感病毒神经氨酸酶对奥司他韦的耐药机制研究
[目的]揭示H274Y突变型H5N1流感病毒神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)对奥司他韦(Oseltamivir,OTV)产生耐药的机制.[方法]利用BLAST序列比对工具和MOE软件的蛋白质结构比对模块,对野生型和突变型NA(PDB ID:3TI6和3CL0)的一级结构、二级结构、三级结构以及活性位点进行比对,在分子水平探讨H274Y突变型H5N1流感病毒NA对OTV产生耐药的机制.[结果]3CL0中S1区与OTV羧基形成氢键作用的残基由保守残基Arg292变为了非保守残基Asn347;在S2区增加了OTV与Ile222的疏水作用;由于受到突变后酪氨酸残基较大侧链对羟基苄基的空间位阻作用,3CL0中Glu276的空间形态发生较大变化,影响了活性位点S5疏水口袋的形成.[结论]3CL0活性位点S1区保守残基与OTV的氢键作用被非保守残基取代,S2区突变型NA与OTV之间的疏水作用增加,且突变残基的空间位阻影响了活性位点S5区疏水口袋的形成,均可能是造成H274Y突变型H5N1流感病毒NA对OTV耐药的重要原因.
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副黏病毒Tianjin株重组血凝素-神经氨酸酶单克隆抗体的制备及在临床检测中的初步应用
目的:建立双抗体夹心ELISA法,调查副黏病毒Tianjin株引起婴幼儿下呼吸道感染情况.方法:用纯化的重组HN片段免疫BALB/c小鼠,按常规方法制备单克隆抗体.以兔抗Tianjin株多克隆抗体为捕获抗体,单抗G7G7E7为检测抗体,建立双抗体夹心ELISA法,检测104例下呼吸道感染患儿支气管肺泡灌洗液(BALF)标本.结果:获得3株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株G7H4D3、G7D9G3和G7G7E7.3株单克隆抗体与副黏病毒Tianjin株有较高结合活性,与甲、乙型流感病毒,新城疫病毒(NDV),人副流感病毒(hPIV)1型、3型、肺炎支原体均无交叉反应性.ELISA相加试验和阻断试验表明,3株单抗识别相同或相近表位区域,识别的表位在抗病毒免疫应答中处于免疫优势地位.双抗体夹心EHSA法检测阳性率为1.92%(2/104).结论:与RT-PCR和间接ELISA法比较,双抗体夹心ELISA法,具有敏感性高、特异性强的优点,适于临床检测使用.副黏病毒Tianjin株是婴幼儿下呼吸道感染的重要致病因子之一.
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神经氨酸酶抑制剂的研究进展
流感病毒感染所致的急性呼吸道疾病(流感)是一种严重危害人类健康的传染病,在全世界范围流行,患病率和病死率均居高不下.由于流感病毒抗原变异性和特异性的疫苗研制的滞后性,常规的疫苗不能有效地预防流感暴发与流行.因此,抗病毒药物就成为了抗病毒的第一道防线.目前被批准上市的抗病毒药物有M2离子通道阻滞剂和神经氨酸酶抑制剂(neuraminidase inhibitors,NAIs)两大类.M2离子通道阻滞剂不良反应大,且只能防治甲型流感病毒,对乙型流感病毒无效;NAIs可以抑制高致病性的甲型和乙型流感病毒,已成为目前抗病毒药物研究的热点.目前已经上市的NAIs有奥司他韦、扎那米韦和帕拉米韦.本文介绍了NAIs的作用机制、药效学、药动学并着重对NAIs的临床研究进展进行综述.
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流感病毒疫苗研究进展
流感是由流感病毒所引起的一种急性呼吸道传播疾病，可季节性地感染禽类、哺乳动物和人类。流感病毒又可分为A、B、C三种类型，其中以A型流感病毒的暴发为频繁。甲型流感病毒属于正黏病毒科[1]，其基因组共由8个独立的单链RNA片段组成，编码10种蛋白：血凝素蛋白（HA）；基质蛋白（M）分为M1和M2；神经氨酸酶（NA）；核壳蛋白（NP）；非结构蛋白（NS）包括NS1和NEP；PB1，PB2和PA三种聚合酶，每种多肽对于流感病毒都具有重要的生物学功能。甲型流感病毒根据其主要表面抗原HA和NA的抗原性的差异分为不同亚型，目前已发现了17种亚型的HA蛋白，和10种亚型的NA蛋白[2]。具有高度传染性，经常在短期内突然暴发并迅速蔓延，造成不同程度的流行。早在1580年，流感暴发就首次为人类所详尽记载，近年来流感病毒的暴发也越来越频繁，如2009年暴发于美洲的H1N1甲型流感和在香港引起恐慌的H3N2流感，以及2013年在我国长江流域暴发的H7N9禽流感。
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治疗与预防流行性感冒的新药物
病毒表面存在着两种糖蛋白分子——血球凝集素(haemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(neuraminidase,NA)。血球凝集素可识别细胞的受体并与之结合促使病毒与细胞的融合，启动病毒进入细胞的过程；神经氨酸酶则可直接与细胞表面的神经氨酸分子结合，破坏细胞膜，使病毒感染细胞［1］。呼吸道多种粘蛋白均含有神经氨酸的基团，因此，流感病毒的神经氨酸酶也有利于病毒通过分泌液感染细胞。新装配成的流感病毒从细胞中释放出来也需要病毒神经氨酸酶的开路，破坏细胞膜上含有神经氨酸基团的糖蛋白，病毒才能顺利地从细胞中释放出来。在存在神经氨酸酶抑制物的时候，流感病毒既难以感染细胞，新生病毒也难以从感染细胞中释放出来［2］。
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H7N9禽流感病毒重组质粒构建及应用
目的 构建一种含H7N9禽流感病毒全长血凝素/神经氨酸酶/基质蛋白(HA/NA/M)基因的重组质粒,为核酸检测方法提供一种通用的阳性定量标准品.方法 设计H7N9禽流感病毒HA、NA及M抗原基因全长开放阅读框的克隆引物,提取H7N9禽流感病毒总RNA后用实时荧光定量PCR获得相应片段,用3次酶切连接方法,依次插入到pGEM-T easy质粒,进行测序确认;线性化后的重组质粒用T7 RNA聚合酶进行体外转录,RNA转录产物纯化后测定浓度,用实时荧光定量PCR构建标准曲线进行验证.结果 HA、NA和M基因扩增片段大小分别约为1.7、1.3、1.1 kb,与预期相符;构建的重组质粒pGEM-HA-NA-M插入片段的测序结果与GenBank公布序列一致;由重组质粒体外转录获得同时含有H7N9禽流感病毒HA、NA、M全长开放阅读框序列的RNA片段质量浓度为399.5 ng/μL,梯度稀释后用3种实时荧光定量PCR方法均获得了良好的标准曲线.结论 成功构建重组质粒pGEM-HA-NA-M,由此质粒体外转录获得的RNA片段可作为H7N9禽流感病毒核酸快速检测方法通用的阳性定量标准品.
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禽流行性感冒(禽流感)
1概况和历史禽流感(Avian Influenza,AI)是指由禽流感病毒引起的一种人、禽、畜共患的急性传染病.但它在不同宿主间所表现出的流行病学特点和临床症状差异甚远.到现在为止,已发现的甲型流感病毒血凝素有15个亚型(H1-15),神经氨酸酶有9个亚型(N1-9),它们均己从禽中被分离.
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流感病毒的病原学快速诊断
流感病毒可引起世界性的大流行,严重威胁着人类的健康.因此,建立一套早期、快速的检测方法就能进行有效的治疗.目前流感病毒的快速诊断主要包括病毒抗原检测、特异性基因片段检测及神经氨酸酶检测.本文从上述三个方面进行综述.
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靶向于流感病毒神经氨酸酶新位点的抑制剂研究进展
流感是由流感病毒引起的一种严重影响人类生命健康的传染性疾病.神经氨酸酶是流感病毒表面的一种重要糖蛋白,在病毒的复制周期中起着关键作用,是抗流感病毒合理药物设计的理想靶点.自2006年以来,结构生物学研究发现了神经氨酸酶新的配体结合位点,为新型神经氨酸酶抑制剂的设计提供了依据.本文综述了靶向于神经氨酸酶新结合位点的抑制剂的研究.
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新型抗流感药
一、抗流感药物开发沿革1983年,Colman分析流感病毒神经氨酸酶结构成功,发现含于该酶的氨基酸无论甲型或乙型病毒均呈共同性.流感病毒之于细胞间的扩散,如果不借助于神经氨酸酶是不可能实现的.所以,药物倘能占据此酶的活性位点,或能阻碍其活性作用,则可成功开发出甲、乙两型共同的抗流感药物.
