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荧光PCR探针熔解曲线法检测结核分枝杆菌耐利福平突变研究
目的 对荧光PCR熔解曲线法检测结核分枝杆菌耐利福平突变方法进行临床研究,评价检测能力及在国境口岸的应用价值.方法 应用荧光PCR熔解曲线法检测结核病人临床分离结核分枝杆菌,以传统药物敏感性试验为标准,获得该方法的灵敏性、特异性.结果 对347例结核病人临床分离培养样本,传统药物敏感性试验检出271例利福平敏感标本,76例利福平耐药标本.荧光PCR熔解曲线法检出269例利福平敏感标本,78例利福平耐药标本,灵敏性为93.42％,特异性为97.42％,符合率为96.54％.结论 荧光PCR熔解曲线法检测速度快速、灵敏度高、特异性强,可用于结核分枝杆菌利福平耐药突变的快速检测,适于国境口岸对耐多药结核病的快速筛查.
关键词： 关键词:结核分枝杆菌 熔解曲线法 利福平 检测 -
探针熔解曲线法检测痰结核杆菌耐异烟肼突变
目的 评价荧光定量PCR探针熔解曲线法快速筛选痰中耐异烟肼结核分枝杆菌菌株的检测效能.方法 筛选收集培养阳性肺结核患者的痰标本,对鉴定为结核分枝杆菌的痰标本同时使用比例法药敏试验和PCR探针熔解曲线法进行耐异烟肼检测.结果 与比例法比较,熔解曲线法检测异烟肼灵敏度为86.31％(82/95),特异性为96.83％(275/284),二者一致率为94.20％(357/379).结论 荧光PCR探针熔解曲线法可快速检测培阳痰标本中的结核分枝杆菌耐异烟肼突变基因,适用基础结核病实验室对耐异烟肼结核病患者的快速筛查.
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高分辨率熔解曲线法检测临床常见KPC基因亚型
KPC是一种近年新出现的碳青霉烯酶,可以水解包括碳青霉烯类抗菌药物在内的所有β内酰胺类抗菌药物,且仅轻微或不被克拉维酸抑制,给临床治疗带来极大困难[1].目前已经公开报道的亚型有KPC-2至KPC-11,但临床中流行的主要是产KPC-2或KPC-3的肺炎克雷伯菌[2],在国内报道的均为KPC-2型[3-6],本研究拟建立一种经济、快速、高通量的检测临床常见KPC基因亚型方法.
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熔解曲线法在结核分枝杆菌药敏试验质量评估中的应用
目的 探讨熔解曲线法用于结核分枝杆菌药敏试验质量评估的可行性.方法 以2009年5月至2012年9月间上海市松江区和其他5个区县级结核病诊疗机构收集的2 204株结核分枝杆菌临床菌株为研究对象,比较熔解曲线法的耐药基因型检测结果与比例法药敏试验结果的符合度.对松江区结果不一致的菌株进行盲法复检,并用基因测序方法确定耐药突变类型.结果 上海市松江区的评估结果显示,耐药基因型的分子诊断结果与利福平和异烟肼的药敏试验结果高度一致(κ值分别为0.97和0.99),利福平耐药株的阳性符合度、阴性符合度及总符合度分别为97.6％(41/42)、100％ (757/757)和99.9％(788/799),异烟肼分别为100％ (72/72)、99.9％(726/727)和99.9％(798/799).盲法复检显示,熔解曲线法诊断的2次检测结果完全相同,具有很好的重复性.而在其他5个诊疗机构(A ～E),熔解曲线法与药敏试验结果的阳性符合度为87.5％(21/24)、80.8％(21/26)、87.5％ (14/16)、82.9％(29/35)和60.9％ (14/23),异烟肼耐药检测相关数据为88.2％(30/34)、65.6％(21/32)、85.0％(17/20)、68.3％(41/60)和62.5％(15/24),不同诊疗机构之间结果差异具有统计学意义,提示部分诊疗机构可能存在漏检耐药病例的问题.结论 熔解曲线法操作简便,耗时短,且重复性好,能及时发现日常工作中存在的问题,适于药敏试验的质量评估.
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荧光PCR熔解曲线法检测结核分枝杆菌耐利福平突变研究
目的 对荧光PCR熔解曲线法检测结核分枝杆菌耐利福平突变方法进行临床研究,评价其检测效能及在国境口岸应用价值.方法 应用荧光PCR熔解曲线法检测结核病人临床分离标本,与传统药物敏感性试验对比,衡量该方法的灵敏度、特异性.结果 对347例结核病人临床分离培养样本,药敏试验检出271例利福平敏感标本,76例利福平耐药标本；荧光PCR熔解曲线法检出269例利福平敏感标本,78例利福平耐药标本,灵敏度为93.42％,特异性为97.42％,符合率为96.54％.结论 荧光PCR熔解曲线法检测速度快速、灵敏度高、特异性强,可用于结核分枝杆菌利福平耐药突变的快速检测,适于国境口岸对耐多药结核病的快速筛查.
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熔解曲线法快速分析我国常见三种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因突变
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺乏症是我国长江流域以南常见的一种遗传病.G6PD缺乏症的主要原因是基因的点突变,引起我国人群G6PD缺乏症的主要突变有12种,其中为常见的是G1376T、G1388A、A95G[1].
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建立PCR熔解曲线法检测HBV基因型
目的 建立检测HBV基因型的PCR熔解曲线法,并验证该方法 临床应用的可靠性.方法 依据文献报道的HBV B、C型全基因组序列,分别设计B、C型的特异引物序列,建立HBV基因分型的PCR熔解曲线法.用该法检测186例HBV DNA阳性血清样本,并从中选取51例样本,用商品化的HBV基因分型试剂盒进行检测,用Kappa一致性检验对两法检测结果 进行比较.结果 186例标本中,PCR熔解曲线法检测到B型133例(71.5%),C型37例(19.9%),B/C混合型16例(占8.6%).选取的51例样本中,熔解曲线法与市售试剂盒检测B型符合率100%,C型符合率100%,B/C混合型符合率81.25%,总符合率94.1%(Kappa=0.909,P<0.05).结果 建立的PCR熔解曲线法操作简便,与商品试剂盒的检测结果 有较高的符合率,可用于临床上HBV B、C以及B/C混合型的检测.
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PCR熔解曲线法检测MTHFR 677T基因多态性在H型高血压诊治中的应用
高同型半胱氨酸血症是指血浆同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）水平的异常升高（Hcy≥10μmol/L）。亚甲基四氢叶酸还原酶（methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）是同型半胱氨酸代谢过程中较为重要的关键酶，MTHFR677C/T多态性可引起血浆Hcy水平的增高，研究发现MTHFR677C/T突变是中国人患有高同型半胱氨酸血症的重要原因之一［1］。目前MTHFR 677C/T基因型的检测均采用DNA测序法，但是操作复杂，耗时长，限制了其在临床的应用。作者自2013年8月至10月采用PCR熔解曲线法对200例高血压患者进行MTHFR 677C/T基因型的检测，并通过与DNA测序法进行对比，探讨PCR熔解曲线法检测MTHFR C677T基因型的方法及该检测法的准确性，同时探讨患者血浆Hcy的水平、H型高血压发生率与MTHFR677C/T基因型的相关性。
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实时荧光聚合酶链反应检测乙肝病毒YMDD变异标本影响因素的研究
目的探讨标本贮存温度、血红蛋白、高胆红素因素对熔解曲线法检测HBV-YMDD变异结果的影响.方法服用拉米夫定出现YMDD变异株的慢性乙型肝炎患者的血清,在不同的贮存温度、血红蛋白、胆红素浓度下,用杂交探针溶解曲线法检测,观察其荧光扩增曲线的C1值及熔解曲线的Tm值.结果在4℃和25℃贮存的血清标本,其Ct值与对照组比较有显著性差异(P＜0.001);在-20℃贮存温度下,其Ct值与对照组比较无显著性差异(P＞0.05);Hb浓度为60μg/L及600μg/L的血清标本,其Ct值与空白对照组比较均有显著性差异(P＜0.001);胆红素浓度为25.6μg/L及45.2μg/L的血清标本,其Ct值与对照组比较均有显著性差异(P＜0.001).熔解曲线的Tm值与对照组比较均无显著性差异(P＞0.05).结论标本贮存温度、血红蛋白、高胆红素因素对实时荧光聚合酶链反应检测乙肝病毒YMDD变异结果有影响,尤其是低拷贝HBV-DNA的血清标本,上述因素可能会导致结果的假阴性;对基因分型特异性无明显影响.
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福州市乙型肝炎病毒基因型分布及其临床意义
目的：分析福州市乙型肝炎病毒(HBV)感染者病毒基因型分布情况及其与部分临床指标的关系。方法收集346份 HBV DNA 阳性标本,利用 PCR 熔解曲线法检测其基因型,同时进行 HBeAg 定量的检测,其中91例经肝脏穿刺确诊为肝纤维化。根据分型结果探讨基因型与肝纤维化、HBeAg 阳性率以及 HBV DNA 水平的关系。结果346例 HBV 感染者中,检出 B 型193例,占55.78%；检出 C 型95例,占27.46%；检出 B/C 混合型58例,占16.76%。91例肝纤维化标本中,检出 C 型39例,占42.86%(39/91),显著高于 C 型在全部研究对象中所占的比例(27.46%,82/346)；检出 B 型38例,占41.76%(38/91),低于 B 型在全部研究对象中所占的比例(55.78%,193/346)。对346例标本进行 HBV DNA 定量检测,发现 C 型的病毒载量明显高于 B 型和 B/C 混合型；HBeAg 定量检测发现 C 型的 HBeAg 阳性率(87.37%,83/95)亦显著高于 B 型(68.39%,132/193)和 B/C 混合型(41.38%,24/58),差别均有统计学意义(P <0.05)。结论福州市乙型肝炎患者中以 B 型 HBV 感染为主；肝纤维化、HBeAg 阳性率及 HBV DNA 病毒载量与乙型肝炎患者感染 HBV 的基因型相关；C 型与肝纤维化有关。
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PCR熔解曲线法检测HBV YMDD自然变异
目的 了解未经抗病毒治疗的慢性乙型肝炎(CHB)患者乙肝病毒YMDD自然变异流行状况及特点.方法 选择未接受过抗病毒治疗的慢性乙型肝炎患者119例,采用荧光标记杂交双探针PCR熔解曲线法(FH-PCR-MC)对其血浆标本进行YMDD基因序列突变检测.结果 119例患者中,有23例存在YMDD自然变异毒株,变异检出率为19.3%,其中YVDD阳性者20例(87.0%),YIDD阳性者2例(8.7%),YVDD和YIDD同时阳性者1例(4.3%).23例出现自然变异毒株的患者,其体内病毒均为变异株与野生株共生,且变异株为非优势株,变异株在总病毒量中所占的比例均在50%以下.变异毒株占总病毒量的40%～50%者4例,30%～ 40%者6例,20%～30%者6例,20%以下者7例.结论 未经抗病毒治疗的CHB患者存在YMDD自然变异毒株,且变异株与野生株共生,为非优势株.
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PCR熔解曲线法在结核分枝杆菌耐药性测定的临床价值
目的 探讨PCR熔解曲线法对耐药性测定的临床应用价值.方法 收集广州市胸科医院2016年6月-2016年12月住院200例痰涂片阳性的患者的痰标本,运用PCR熔解曲线法和培养药敏法分别进行检测耐药性,评价两种方法检测的一致性.结果 PCR熔解曲线法在初治患者中,检测异烟肼耐药情况的灵敏度为71.43％,特异度为96.77％,一致性为94.34％;检测利福平耐药情况的灵敏度为80％,特异度为97.92％,一致性为96.23％.在复治患者中,检测异烟肼耐药情况的灵敏度为35％,特异度为81.25％,一致性为55.56％;检测利福平耐药情况的灵敏度为82.35％,特异度为94.74％,一致性为88.89％.结论 PCR熔解曲线法检测方法快速,可用于初治患者利福平、异烟肼耐药性的快速检测和复治患者利福平耐药性的快速检测,可指导临床用药;但对复治患者异烟肼耐药性检测准确度不够.
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基因交互作用预测高原红细胞增多症的遗传易感性研究
目的：本研究拟探讨SENP1、VEGF以及CARD14交互作用在预测移居汉族男性高原红细胞增多症遗传易感性的作用。方法：纳入234例移居汉族男性高原红细胞增多症（ HAPC）患者与250例移居汉族男性正常对照， PCR－高分辨率熔解曲线法判定SENP1基因rs726354、VEGF基因rs3025033及CARD14基因rs8065364等多态性位点的基因型，多因子降维软件分析基因之间的交互作用。结果：rs726354多态性位点以及rs3025033多态性位点基因型与等位基因频率在HAPC组与正常对照组的分布无差异；CARD14基因rs8065364的3种基因型在HAPC组与正常对照组的频率分布存在差异，HAPC组与正常对照组C等位基因与T等位基因频率存在差异。基因交互作用提示上述3个多态性位点的不同组合可影响移居汉族男性HAPC的易感性。结论：CARD14基因rs8065364多态性与移居汉族男性HAPC的发生存在相关性，C等位基因是汉族男性HAPC的危险因素，SENP1基因、VEGF基因以及CARD14基因的交互作用可能参与了移居汉族男性HAPC的发生。
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荧光 PCR 熔解曲线法在结核分枝杆菌耐药检测中的临床应用
目的：评价荧光 PCR 熔解曲线法在结核分枝杆菌耐药检出中的临床应用价值。方法以改良罗氏培养法及绝对浓度法作为对比，利用荧光 PCR 熔解曲线法检测53例肺结核患者对利福平、异烟肼耐药情况。结果两种方法的单耐药率、耐多药率比较差异无统计学意义（P ＞0．05）。同一标本两种方法检测对比显示，与绝对浓度法相比，熔解曲线法检测利福平、异烟肼耐药的敏感度分别为80．0％和81．0％，特异度分别为100．0％和93．8％，准确度分别为92．2％和86．8％，两种方检测法的一致性分析 Kappa 值分别为0．754和0．710，表明两者一致性佳。结论相对于传统方法，熔解曲线法敏感度、特异度良好且安全、高效，在耐药肺结核治疗中有良好的应用价值。
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乙型肝炎病毒YMDD自然变异与抗病毒治疗后变异特点
目的 了解未经拉米夫定抗病毒治疗的慢性乙型肝炎(CHB)患者和经拉米夫定治疗后的CHB患者乙型肝炎病毒基因组P区多聚酶YMDD变异情况,观察其特点.方法 选择未接受过抗病毒治疗的CHB患者119例和经拉米夫定治疗后无明显效果的CHB患者30例,采用荧光标记杂交双探针聚合酶链反应熔解曲线法(FH-PCR-MC)对其血浆标本进行YMDD基因序列突变检测.结果 119例未接受过抗病毒治疗的患者,变异检出率为19.3%(23/119),23例出现自然变异毒株的患者,其体内病毒均为变异株与野生株共生,且变异株为非优势株,变异株在总病毒量中所占的比例均在50%以下,变异类型以YVDD为主(20例).30例经拉米夫定治疗的患者变异检出率为56.7%(17/30),17例阳性患者有11例患者体内病毒完全为变异毒株,仅6例患者为变异株与野生株共生,且变异株为优势株者占83.3%(5/6);在变异类型上YVDD占8例,居多;YVDD与YIDD同时阳性占3例.结论 未经抗病毒治疗的CHB患者存在YMDD自然变异毒株,且变异株皆与野生株共生,变异株为非优势株.经拉米夫定治疗后的变异多数为完全变异,少数为变异株与野生株共生,且变异株大多为优势株.
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荧光PCR探针熔解曲线法检测结核分枝杆菌耐异烟肼突变
目的 研究荧光PCR熔解曲线法检测结核分枝杆菌耐异烟肼突变方法,评价检测耐多药结核病的能力.方法 对结核病人临床分离结核分枝杆菌使用荧光PCR熔解曲线法检测,与金标准传统药物敏感性试验比较,获得该方法的灵敏度、特异度和一致率.结果 检测408例结核病人临床分离培养样本,药敏试验检出278例异烟肼敏感标本,130例异烟肼耐药标本;荧光PCR探针熔解曲线法检出异烟肼敏感和耐药标本281例、127例,灵敏度为87.69％,特异性为95.32％,一致率为92.89％.结论 荧光PCR探针熔解曲线法检测速度快速、特异性强、灵敏度较高,可用于结核分枝杆菌耐异烟肼突变的快速检测,适于耐多药结核病的快速筛查.
