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孕期沙眼衣原体、支原体感染结局及母婴传播
目的:探讨孕期沙眼衣原体、支原体感染的妊娠结局和母婴传播途径.方法:采用沙眼衣原体、支原体属单克隆抗体免疫荧光法检测孕妇感染情况,观察孕期单项感染、混合感染及未感染者产时并发症、早产及胎儿异常,新生儿等情况.并在产时对孕期感染者的羊水、胎膜、胎盘、脐血、新生儿、死婴,应用McCoy传代细胞法和双相一步法,进行沙眼衣原体、解脲脲原体细胞培养,并将胎盘进行病理检测.结果:孕期感染与早破水、胎儿窘迫、胎盘残留、新生儿窒息无关;衣原体感染与胎膜残留有关(P＜0.05);混合感染增加了胎儿异常、产后出血率(P＜0.005);单项感染和混合感染均增加胎儿异常、早产、IUGR发生率(P＜0.01).细胞培养于胎盘、胎膜、脐血、羊水及死胎、活婴口腔、体液中找到衣原体和解脲脲原体.通过病理检测证实感染可造成胎盘功能不全.结论:孕期沙眼衣原体、支原体感染,可致病原菌上行,不同程度地感染胎盘、脐血、胎膜,污染羊水,致胎儿不良后果.
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绿色荧光蛋白在大肠杆菌O157∶H7检测中的应用
目的将绿色荧光特征引入大肠杆菌E.coli O157∶H7,用于传统检测方法的改进及目的菌的应用研究. 方法将pGFP质粒转化E.coli O157∶H7,构建一种工程菌(E.coli O157∶H7- pGFP),并进行了选择性培养基的筛选.以E.coli O157∶H7- pGFP对鸡肉与牛奶等食品样品进行接种与回收试验,同时设定不同温度模拟食品储存的不同情况.结果 pGFP质粒可以在E.coli O157∶H7菌株中稳定存在.将E.coli O157∶H7-pGFP接种食品样品,以LBan培养基平板回收发现:较高温度存放肉类与牛奶,其污染的E.coli O157∶H7菌量可在12 h增加35 000～200 000倍,而4℃存放可以使污染菌量缓慢下降.结论构建了一种具有紫外灯下发出绿色荧光与氨苄青霉素抗性等特性的重组菌株--O157∶H7-pGFP,并设计了适合E.coli O157∶H7-pGFP生长的选择性培养基--LBan.该重组菌株可应用于检测方法的改进及该菌特性的研究,是一种非常有用的工程菌.
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新布尼亚病毒IgG抗体间接免疫荧光检测方法的建立
目的 建立检测新布尼亚病毒IgG抗体的间接免疫荧光(IFA)方法.方法 用分离到的5株新布尼亚病毒株感染非洲绿猴肾(Vero)细胞,制备抗原片,优化IFA工作条件,进行IFA法的特异度和敏感度评价,应用建立的IFA方法对2007-2011年在河南省信阳地区采集的126例发热伴血小板减少综合征患者急性期和恢复期双份血清标本进行检测,并与RT-PCR方法的检测结果进行比较.结果 筛选出免疫荧光反应特异、稳定性较好的WZ69毒株作为建立新布尼亚病毒IFA检测方法的抗原种子株.IFA方法的佳工作条件:一抗(患者血清)适稀释度为1∶40；二抗(异硫氰酸荧光素标记的羊抗人IgG抗体)适稀释度为1∶150；二抗中伊文思蓝适稀释度为1∶20000.在126例患者中,新布尼亚病毒IgG抗体阳性者96例,阴性者30例,抗体阳性率为76.19％,与RT-PCR的检测阳性率[72.22％(91/126)]差异无统计学意义(P＞0.05).结论 建立的新布尼亚病毒IgG抗体IFA检测方法敏感性高,特异性强,操作简单,可用于新布尼亚病毒致发热伴血小板减少综合征患者的实验室检测.
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直接免疫荧光法和实时荧光定量PCR法检测汉坦病毒效果的比较
目的 比较直接免疫荧光法(DFA)和实时荧光定量PCR法检测鼠肺汉坦病毒(HV)带毒效果的差异.方法 于2012年4-10月在陕西省户县、泾阳县和眉县3个肾综合征出血热(HFRS)高发县的居民区和野外鼠类活动地,采用鼠夹法捕获野鼠和家鼠共479只.解剖取鼠肺,1份鼠肺经冰冻切片后免疫荧光染色检测HV抗原,另l份经抽提组织RNA后应用实时荧光定量PCR法检测HV核酸.比较2种方法的病毒阳性检出率和检测结果的一致性.结果 捕获的479只鼠中,包括家鼠105只、野鼠374只.DFA和实时荧光定量PCR两种方法在家鼠肺中均未检出HV,而DFA法检测野鼠带毒率为13.1％ (49/374),实时荧光定量PCR法检测野鼠带毒率为14.7％(55/374),差异无统计学意义(x2=0.402,P=0.526).对每份鼠肺标本分别检测,DFA法检测鼠肺HV带毒率为10.2％(49/479),实时荧光定量PCR法检测带毒率为11.5％ (55/479),两种方法比较差异无统计学意义(x2=1.286,P=0.257),检测结果Kappa一致性系数(K)为68.2％,两种方法结果有高度一致性(u =11.759,P＜0.05).以DFA法为标准,实时荧光定量PCR法在检测鼠肺HV的灵敏度为77.6％(38/49),特异度为96.1％ (413/430).DFA检测的9个疑似阳性结果中6个被实时荧光定量PCR方法证实,3个被否定.结论 与DFA法相比,实时荧光定量PCR法同样可用于检测鼠肺中HV带毒率,而且结果更稳定.
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直标法流式细胞术测定人红细胞表面CD35水平的方法学研究
为研究直标法流式细胞术测定红细胞表面CD35免疫分子水平的方法,抽取健康献血员静脉血,采用直标法流式细胞术测定红细胞CD35水平,研究测试后数据分析方法的可靠性和测试前抗凝剂、标本放置时间和抗体用量等因素对测定结果的影响.结果显示:M1界值选择对CD35阳性红细胞(CD35+-E)百分率计算结果有很大影响,CD35几何平均荧光强度(CD35-GMFI)随FL2通道电压升高而增加,而CD35相对几何平均荧光强度(CD35-rGMFI)不受电压影响;EDTA-2K、肝素锂、枸橼酸钠三种抗凝剂以及标本放置72h内CD35+-E百分率和CD35-rGMFI结果均无明显差异(P＞0.05);取5×105个人红细胞反应时,适合的鼠抗人CD35单克隆抗体量为7μL.可见,CD35-rGMFI是描述红细胞表面CD35水平的理想指标,抗凝剂、标本放置时间对测定结果无明显影响,当红细胞数量为5×105时,佳抗体用量为7μL.
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细胞分化及细胞间连接蛋白在睑裂斑上皮细胞中的表达
、E-cadherin和β-catenin的表达明显增强(3242.45±3056.78、2324.05±2598.64、8979.97±3777.61),K19表达下降甚至阴性表达(5995.64±5140.48).K10、K19、E-cadherin和β-catenin在正常结膜与睑裂斑的上皮细胞中阳性表达的吸光度值差异有统计学意义(P<0.05).结论 K19、K10、E-cadherin和β-catenin蛋白在睑裂斑上皮细胞异常表达,提示其上皮细胞存在鳞状上皮化生现象.
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九项呼吸道联检试剂对多种呼吸道感染病原体检测的临床意义
目的 为临床提供一种快速诊断呼吸道感染病原体的方法.方法 对1318例呼吸道感染患者的血清标本应用九项呼吸道联检试剂(间接免疫荧光法)同时检测九项主要病原体的IgM抗体,包括嗜肺军团菌(LP)、肺炎支原体(MP)、Q热立克次体(COX)、肺炎衣原体(CP)、腺病毒(ADV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、甲型流感病毒(IFA)、乙型流感病毒(IFB)和副流感病毒1、2和3型(PIVS).结果 非典型病原体感染率为33.3％(439/1318),其中以肺炎支原体为多见,其次为呼吸道合胞病毒,流感病毒B、A次之；混合感染率达15.7％(207/1318)；感染人群以儿童多见.结论 九项呼吸道联检试剂(间接免疫荧光法)检测快速、操作简便、准确性高,检测范围广、利于早期发现,费用不高,适合各大医院推广应用.
关键词： 呼吸道感染 无特异性病原体有机物 荧光抗体技术 间接 抗体 -
茎环法通用探针定量检测成熟型微RNA方法的建立
目的 建立通用型荧光探针用于不同成熟型微RNA的定量检测.方法 基于茎环法发明者发明且目前应用为广泛的茎环框架,采用Primer Premier 5.0软件在其茎环框架内部设计了一通用的荧光探针及不同的引物对.采用以上探针和引物对对hsa-miR-143-3p,hsa-miR-145-5p,hsa-miR-124-3p,hsa-miR-339-5p,hsa-miR-361-5p,hsa-miR-423-3p和hsa-miR-486-5p进行定量检测.结果 结果表明该通用型荧光探针可用于不同成熟型微RNA(hsa-miR-143-3p,hsa-miR-145-5p,hsa-miR-124-3p,hsa-miR-339-5p,hsa-miR-361-5p,hsa-miR-423-3p,hsa-miR-486-5p)的定量检测.结论该通用型探针可用于茎环法定量检微RNA,可让定量更加准确、实验成本更低.理论上该探针可以用于所有的成熟型微RNA进行荧光定量PCR检测.
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细菌性阴道病患者病原体的检测
细菌性阴道病(BV)为妇科常见病、多发病,病原体以检出阴道加德纳菌(Gardnerella vaginalis,GV)的报道居多[1],而同时检出其他病原体的报告甚少.为探讨BV患者阴道病原分布及诊断价值,采用荧光定量PCR技术及直接荧光抗体技术等检测了368例确诊BV患者阴道分泌物中GV、UU、霉菌、滴虫的感染水平,并观察了部分患者治疗后的GV变化.
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上皮型钙黏附蛋白、CD44v6及连接蛋白43在肝细胞癌中的表达及意义
目的 研究上皮型钙黏附蛋白(E-cad)、CD44v6和连接蛋白43(Cx43)在人肝细胞癌(HCC)中的表达及其表达与患者性别、年龄和组织学分级的关系.方法 采用免疫荧光双标记染色技术结合激光扫描共聚焦显微镜观察E-cad、CD44v6及Cx43在30例正常肝组织,25例肝良性病变和38例HCC中的表达;另在HCC组检测并分析了该3种标记物的表达与性别、年龄和组织学分级的关系.结果 E-cad与Cx43均在正常肝组织及肝良性病变组高表达,而在HCC组表达都明显降低,前两组与HCC组间表达强度差异均有统计学意义(FE-cad=879.2,FCx43=303.7,P＜0.05).相反,CD44v6在正常肝组织及肝良性病变组表达较低,而在HCC中表达较高,差异有统计学意义(F=2057.2,P＜0.05).HCC组E-cad和Cx43阳性表达强度在患者不同性别、年龄及肿瘤的组织学分级间的差异均无统计学意义(P＞0.05);而CD44v6表达与HCC的组织学分级有关,HCC分化差,CD44v6表达高(t=-2.06,P＜0.05),但不同年龄、性别组HCC的CD44v6阳性表达强度差异无统计学意义(P＞0.05).HCC组E-cad与Cx43的表达呈正相关,而E-cad、Cx43与CD44v6的表达呈负相关.结论 HCC的发生、发展伴随着多种分子表型的改变.E-cad、Cx43的低表达与CD44v6的高表达可能参与HCC的侵袭,尤其是CD44v6的表达还与HCC的组织学分级相关.三者联合检测对判断HCC的诊断和预后有一定价值.
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不同转移潜能的人体横纹肌肉瘤细胞系细胞间通讯的研究
目的研究细胞间通讯功能在3种不同转移潜能的人体横纹肌肉瘤细胞系间及其与培养的正常人肌母细胞的差别及其意义.方法采用间接免疫荧光法,用激光扫描共聚焦显微镜定量测定与细胞间通讯有关的间隙连接蛋白(connexin43,CX43)的含量,并用荧光漂白后恢复技术检测间隙连接介导的细胞间通讯的功能.结果 CX43在正常肌母细胞中呈高表达,主要定位于细胞膜,有时定位于胞质,而在横纹肌肉瘤中表达下降;CX43阳性率及荧光强度均随着横纹肌肉瘤转移潜能的增加而降低(P＜0.05);荧光漂白后恢复技术结果显示横纹肌肉瘤细胞荧光漂白后恢复率下降而且与横纹肌肉瘤细胞的转移潜能呈负相关(P＜0.05).结论不同程度细胞间通讯功能的抑制可能与横纹肌肉瘤的转移潜能不同有关,其有可能成为判断横纹肌肉瘤恶性程度及预后的指标之一.
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量子点探针对人肝癌裸鼠模型的体内靶向成像研究
目的 研究量子点标记靶向探针对人肝癌裸鼠模型的体内成像技术.方法 将巯基乙酸修饰的水溶性量子点结合鼠抗人甲胎蛋白(AFP)单克隆抗体制备成水溶性量子点-AFP-Ab复合物探针.荧光、紫外光光谱分析及透射电镜研究其特性.通过直接免疫荧光法,用该复合物探针特异性识别肝癌细胞株HCCLM6 AFP抗原.将体外培养的肝癌细胞株HCCLM6通过皮下接种和尾静脉注射裸鼠分别建立人肝癌裸鼠模型和肺转移模型.尾静脉注射量子点-AFP-Ab探针,用蓝光二极管照射获得活体荧光成像;用掺Ti蓝宝石激光器照射,对肿瘤部位和正常部位进行光谱分析.取血清检测丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶、尿素氮和肌苷水平.取裸鼠肝、脾、肾、肺、心和脑6种主要实质性器官行振荡切片,共聚焦显微镜观察,研究量子点-AFP-Ab探针在裸鼠体内的非特异性摄取.结果 量子点-AFP-Ab复合物探针具有激发光谱宽、荧光强度高的特点,能特异性与肝癌细胞AFP抗原高亲和力结合,在体内能特异性靶向肿瘤组织进行活体成像,无明显急性毒性.光谱分析显示量子点-AFP-Ab复合物探针主要分布于肿瘤的外周部位,少数该探针被肝、脾和肺非特异性摄取.结论 量子点-AFP-Ab复合物探针具有优良的光学特性和生物相容性,能够进行肝癌体内靶向成像,将有助于肝癌的分子靶向研究.
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采用绿色荧光蛋白腺病毒载体表达HBsAgCTL优势表位肽MHC单链三聚体
目的 采用携带GFP报告基因腺病毒载体表达HBsAg细胞毒性T细胞(CIL)表位MHC单链三聚体,为增强HBV特异性免疫提供新方法.方法 构建小鼠MHC Ⅰ类分子(H-2Ld)限制的HBsAg优势CTL表位肽与MHCⅠ类分子重链(Ld)和β2M链(β2-microglobulin,β2微球蛋白)的单链三聚体(HBsAg-SCT).并将HBsAg-SCT亚克隆到GFP标记腺病毒载体,以HBsAg和OVA-SCT作为对照,转染293A细胞,包装产生携带HBsAs-SCT,HBsAg和OVA-SCT的重组腺病毒.结果 经双酶切和克隆测序鉴定,HBsAg-SCT能成功克隆到编码GFP标记的腺病毒载体,通过荧光显微镜观察到转染的293A细胞含有绿色荧光素蛋白.通过Western Blot进一步证实表达的重组蛋白HBsAg-SCT能与抗-腿抗体发生反应.结论 编码HBsAg-SCT的荧光蛋白腺病毒载体成功构建,并能在293A细胞中完整包装成重组腺病毒颗粒.
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广东省严重急性呼吸综合征病毒的分离和鉴定
目的分离和鉴定引起广东省非典型肺炎的病原体.方法收集非典型肺炎患者的各种临床标本,用狗肾传代细胞(MDCK)进行病原体分离,并运用血清学和分子生物学方法进行鉴定.结果用MDCK细胞从非典型性肺炎患者标本中分离到病毒,用SARS病毒聚合酶基因的特异引物,通过巢式聚合酶链反应(nest RT-PCR),扩增出一个279 nt的片段,序列分析结果显示,该序列和目前已知的冠状病毒有39%～65%同源性,和来源于不同地区分离的SARS冠状病毒株(中国北京、香港、台湾和德国、意大利等)在同一个位置(第12个碱基)仅有一个碱基不同,由a→t.间接免疫荧光抗体检测显示,该病毒能够和非典型肺炎患者的恢复期血清呈特异的抗体反应.结论这种新的冠状病毒是引起广东省非典型肺炎的病原,且能够用MDCK细胞进行分离.
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圣路易斯脑炎病毒样颗粒的真核表达、纯化与鉴定
目的 利用293T细胞表达、纯化圣路易斯脑炎病毒样颗粒(Virus like particles,VLPs),为研制圣路易斯脑炎病毒免疫诊断试剂奠定基础.方法 构建含圣路易斯脑炎病毒PrM和E基因的重组质粒pcDNA5/FRT-SJME,瞬时转染293T细胞,表达并纯化重组蛋白,通过透射电镜、间接免疫荧光试验、Western-Blot和ELISA对其进行鉴定.结果 表达的重组蛋白形成50 nm的球型颗粒,能与抗圣路易斯脑炎病毒抗体产生特异性反应,与部分黄病毒属阳性血清发生交叉反应.结论 已成功在哺乳动物细胞中表达并纯化了圣路易斯脑炎病毒样颗粒,其具有良好的抗原性和完整的颗粒形态,为进一步研制圣路易斯脑炎病毒感染的免疫诊断试剂奠定了基础.
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Taqman荧光定量RT-PCR在呼吸道感染患者临床标本非SARS冠状病毒检测中的应用
目的 建立检测四种常见人非SARS冠状病毒核酸特异的快速、敏感的TaqMan qRT-PCR检测方法,应用于急性呼吸道感染患儿的感染分析.方法 分别应用TaqMan qRT-PCR与普通RT-PCR平行检测248份呼吸道标本,对方法的灵敏性、特异性和稳定性以及临床标本的适用性进行比较评价,阳性标本以体外转录RNA为标准品进行病毒载量定量.结果 本方法可对HKU1、NL63、229E、0C43四种冠状病毒进行特异性诊断,与其他病毒无交叉反应,检测灵敏度可达10拷贝/μl,检测线性范围可达101～ 108拷贝/μl,248份标本中HKU1、NL63、229E、OC43阳性率依次为1.2％,0.8％,1.2％,1.6％,其中0C43荧光RT-PCR法检出率高于普通RT-PCR,其余三种病毒两种方法检测结果一致.非SARS冠状病毒阳性标本均检出于12月至次年5月.结论 建立的TaqMan Realtime RT-PCR法具有特异性强、灵敏性高的特点,是开展非SARS冠状病毒的临床检测与疾病监测的有效技术手段.
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人巨细胞病毒感染指示细胞株的建立
目的 建立指示细胞株,该细胞株被人巨细胞病毒(HCMV)感染后能够诱导表达绿色荧光蛋白(GFP).方法 使用PCR方法克隆GFP基因和HCMV UL54基因的启动子(UL54p);用GFP替换质粒pGL4.17[luc2/Neo]中的luc2基因,并将UL54p序列插入多克隆位点得到报告质粒pGL4UL54p-GFP.将该质粒转染永生化的人胚肺成纤维细胞MRC-5T,通过G418筛选,获得多株克隆化的MRC-5TUG细胞.使用HCMV(AD169毒株)感染各株MRC-5TUG,利用荧光显微镜观察GFP表达情况.使用人5型腺病毒和H1N1甲型流感病毒感染筛得的目的细胞株,观察GFP表达情况.结果 构建的报告质粒pGL4UL54p-GFP经酶切和测序鉴定,证实与预计的一致.质粒转染MRC-5T细胞,筛得9株MRC-5TUG克隆化细胞株;HCMV感染后,有2株细胞GFP表达由阴转阳,其中MRC-5TUG#7细胞GFP表达强.人腺病毒和流感 病毒感染MRC-5TUG#7,GFP不表达.结论 成功构建了MRC-5TUG细胞,该细胞可以用于指示HCMV的感染.
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实时荧光定量PCR检测儿童下呼吸道感染的WU多瘤病毒
目的 建立并应用检测儿童下呼吸道感染WU多瘤病毒(WU polyomavirus)的实时荧光定量PCR( real-time fluorescent quantitative PCR,FQ-PCR)方法.方法 选择WU多瘤病毒的VP2基因作为检测的目标基因,设计FQ-PCR引物和检测探针,以重组质粒为标准品建立标准曲线,并对该方法的特异性、灵敏度、重复性进行评价；应用该方法对温州医学院附属温岭医院收集的临床下呼吸道感染患儿的痰液、咽拭子846份及血清标本846份进行定量检测.结果 本研究建立FQ-PCR检测方法,质粒标准曲线的方差系数为0.998,灵敏度可达到50拷贝；应用该方法检测700份痰液标本,检测到7例阳性标本,146份咽试子标本中未检测到阳性标本,总阳性率为1.00％ (7/700),846份血清标本未检测到阳性标本.结论 本研究建立的FQ-PCR方法可以特异、快速、灵敏地对儿童下呼吸道感染的WU多瘤病毒进行定量检测；痰液标本较咽拭子或血清标本更适用于WU多瘤病毒感染的核酸检测.
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B型流感病毒Yamagata系和Victoria系双重荧光PCR诊断方法的建立与应用
目的 建立一种新型的双重荧光PCR诊断方法,用于B型流感病毒By (B/Yamagata)和Bv(B/Victoria)亚系的准确分子分型.方法 从GenBank随机下载By和By HA(hemagglutinin)基因各50条序列,通过MEGA分析,利用Primer Primer软件设计亚系特异性引物和通用探针,建立双重荧光PCR诊断方法.用HAI(hemagglutination inhibition)实验确认的B型流感病毒亚系分离毒株和A型流感病毒进行特异性验证,用体外转录核酸拷贝数进行灵敏度实验.结果 2006-2010流感监测年份,对17 765份流感样病例咽拭标本中分离到B型流感病毒793株,本方法鉴定有152株By和641株Bv病毒,与HAI鉴定结果一致.本诊断方法的检测特异性达100％,灵敏度达102拷贝/μl,重复性变异系数＜3.5％.结论 本研究所建立的荧光PCR方法为流感实时监测提供了有力的技术支撑,适合于流感监测实验室对流感病毒的快速分子诊断.
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汉坦病毒感染的量子点标记免疫检测研究
目的 应用量子点荧光标记技术和间接免疫法,建立一种新的汉坦病毒(HV)感染的免疫检测技术.方法 采用碳二亚胺交联法,在水溶性量子点表面修饰protein G和羊抗人IgG.以HV抗原片为固相载体,QDs-PG-IgG复合物为标记二抗,检测待检血清中的HV特异性抗体,并对检测条件进行优化.结果 量子点与羊抗人IgG的佳偶联条件:反应时间2h、pH 6.0、羊抗人IgG浓度20 μg/ml.检测体系的佳反应条件:量子点标记二抗的适工作浓度为1:200,HV感染阳性血清检测的大稀释度为1:1280.结论 成功建立了简便、快速的HV感染的量子点标记免疫检测方法,该方法具有良好的灵敏度和特异性,抗荧光猝灭性强,为进一步实现HV抗体的单分子定量检测奠定基础.
