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中国TORCH研究进展
TORCH是一组致畸微生物,T即弓形虫(toxoplasma,TP),R即是风疹病毒(rubella virus,RV),C即巨细胞病毒(cytomegaloviruses,CMV),H即单纯疱疹病毒(herpes simplex virus,HSV),O即其他(other,O),这是一组宫内感染致胎儿先天畸形、死胎、早产、流产、智力发育异常等的微生物,有些感染儿虽出生时未发现异常,但在以后儿童期出现先天性耳聋、脉络膜视网膜炎、视力下降、先天性心脏病、智力低下等.西方报道:出生畸形发生率为2%～3%,两年后增加到4%～6%.我国卫生部1986～1987年在全国29个省、市、自治区对1 243 284名围产儿进行监测,发现先天畸形儿16 172例,畸形发生率为1.3%.杨茵[1]报道对613名孕产妇作TORCH-IgM检测(ELISA)正常妊娠者阳性率为15.89%(以HSV1阳性率为高5.93%),异常妊娠者阳性率为41.31%(以HSV1阳性率17.23%为高),后者显著高于前者(P＜0.05).贾杰报道海南产妇血中IgG阳性率以CMV 96.4%为高(新生儿为93.6%),HSV为95.7%(新生儿为95.6%),RV为84.3%(新生儿为82.6%),TP为22.6%(新生儿为6.4%),7例畸形儿中有3例确定为CMV感染,2例为RV感染,2例病原难以确定;9例流产孕妇中3例为RV感染,2例为CMV感染,1例为HSV,1例可能为习惯性流产.
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一起学校风疹暴发的流行病学分析
2000年3月10日至6月20日，宜宾县李场镇中心小学发生一起传入性风疹暴发。全校 6个班共 有师生323名，累计发病161例，罹患率达49.85%。以小学三、四、五年级发病为主，占 发病总数的62.11%，无教师发病。男82例，女79例；发病年龄6～14岁，其中9～11岁占 发病总数的77.64%。本次暴发出现两次发病高峰，第一次小高峰出现在4月20～30 日，发病32例，占19.88%；第二次大高峰出现在5月20日至6月10日，发病110例，占6 8.32%。161例病人均无免疫史。全部病人均有较明显的临床表现，如症状轻，多数无发热 或低热，病程2～4 d，发病1～2 d内即出现遍及全身的淡红色斑疹或斑丘疹 ，疹后1～2 d退疹，不脱屑、不留痕等。5月15日前病人未隔离治疗，5月20日起对病人隔离治疗，全部治愈。对 未患病者采用注射丙种球蛋白被动免疫，疫情得以终止。 本次传入性风疹暴发原因分析：①首例患者的邻居系一外出务工患风疹后返家者，两人关系 甚密；②4月下旬以来，小雨连绵，气温较低，且该校面积较窄，通风不良，使风疹病毒存 活力增强，易于扩散；③该校学生缺乏对风疹病毒的免疫力；④发生疫情后，学校及当地有 关部门未及时报告疫情，特别是出现第一次发病小高峰后，对患者未采取有效隔离治疗措施 ，对易感者未采取有效预防措施，导致出现第二次发病高峰。
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出生缺陷预防控制应采取低成本策略
出生缺陷已成为我国一个重要的人口健康问题.根据国际出生缺陷预防权威机构估计,我国每年诞生的严重出生缺陷患儿约占出生总人口的51.2‰,这还不包括由于妊娠后各种环境致畸物,如致畸药物、碘缺乏、风疹病毒等导致的出生缺陷[1].
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致畸信息服务的研究进展
一、致畸信息服务的建立20世纪前,出生缺陷被认为是遗传因素所引起的.1922年,有作者发现被射线照射的妊娠大鼠的后代可发生眼部缺陷;1933年又有作者发现维生素A缺乏的猪后代发生独眼畸形[1,2].随后,人类资料逐渐发表,1941年澳大利亚发生风疹病毒大流行,大量的先天性心脏病、耳聋和先天性白内障的患儿出现.人类首次证实了孕期风疹病毒感染与胎儿先天性心脏病、耳聋和白内障的发生有密切的关系,人们开始认识到环境因素与胎儿发育以及出生缺陷的关系.20世纪50年代末,震惊全世界的"反应停悲剧"的发生,使人们更加明确地认识到一些药物等环境因素完全能通过胎盘影响胎儿的发育,对孕妇极小或没有毒性的药物但对胎儿可以是致命的,至此,人类对环境因素与出生缺陷的关系才予以肯定[1-3].
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一起双胞胎先天性风疹综合征疫情流行病学调查
2011年11月1日,北京市东城区CDC接到了北京某医院在疫情网上报告2例风疹实验室诊断病例.接到报告后,CDC工作人员迅速展开了流行病学调查.结果证实,2例风疹病例均为先天性风疹病毒( rubella virus,RV)感染所致的实验室确诊先天性风疹综合征(congenital rubella syndrome,CRS).现将调查结果报告如下:
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黄蓝颗粒对风疹病毒抑制作用的临床和实验研究
目的 探讨黄蓝颗粒对风疹病毒抑制作用的疗效及其作用机理.方法 将RuV-IgM阳性患者60例随机分为2组,每组均为30例.治疗组给予黄蓝颗粒(黄芪30 g 板蓝根30 g 贯众30 g,武汉市中西医结合医院制剂室提供)口服,每天1剂,分两次温开水冲服.对照组给予利巴韦林(0.1 g/片)口服,每次0.2 g,每天3次.两组均以20天为1个疗程.观察Ru-IgM转阴率,并检测血清白细胞介素(IL-2)、肿瘤坏死因子(TNF-α)水平.体外实验研究采用细胞病变抑制法在非洲绿猴肾(Vero)细胞培养上测定黄蓝颗粒对RuV Gos株的抑制作用.结果 临床研究表明,治疗组和对照组1个疗程转阴率(分别为86.7%,63.3%)比较,差异有统计学意义(P＜0.05);2个疗程转阴率(分别为100%,86.7%)比较,差异无统计学意义(P＞0.05).RuV-IgM阳性患者IL-2较正常组显著下降,而TNF-α则显著升高;黄蓝颗粒治疗后IL-2和TNF-α恢复至正常水平.体外实验研究发现,黄蓝颗粒对RuV所致细胞病变有明显的抑制作用.结论 黄蓝颗粒在体内外对RuV均有显著的抑制作用,而且能提高机体免疫力,是中医药治疗风疹病毒感染的有效药物.
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2003～2007年中国风疹病毒基因特征分析
本研究用Vero细胞或Vero/SLAM细胞从我国10个省(直辖市、自治区,下同)2003～2007年风疹暴发和散发病例的咽拭子标本中分离到57株风疹病毒,用RT-PCR方法扩增了57株风疹病毒E1基因1 107个核苷酸的片段,并对该PCR产物进行序列测定和分析.结果提示,在基于WHO基因定型靶序列739个核苷酸片段构建的基因亲缘关系树上,其中55株风疹病毒株属于1E基因型,相对于其他国家的1E基因型,形成一个独立分支;另外2株风疹病毒属于2B基因型.57株风疹病毒大部分核苷酸的突变为无义突变,氨基酸序列高度保守,除了2株风疹病毒在E1蛋白血凝抑制和中和位点区域第212位氨基酸由Thr变为Ser,其他病毒株均无重要抗原位点的改变;所有我国已分离到的1E基因型风疹病毒在E1蛋白第338位氨基酸共享突变位点(Leu338→Phe338),而其他基因型以及其他国家的1E基因型风疹病毒在该位点均未发生突变,提示该氨基酸(Phe338)可能是我国1E基因型风疹病毒所特有.2003～2007年在我国10个省均分离到1E基因型,而2B基因型只在2006年从四川省的越南输入病例中分离到,提示1E为绝对优势基因型,2B基因型为输入基因型.与1979～1984年和1999～2002年我国流行的风疹基因型不同,发生了基因型的更替,近年我国风疹的流行是由1E基因型为主的风疹野病毒的多个传播链引起.
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风疹病毒多表位诊断抗原的制备与评价
原核表达与层析纯化获取风疹病毒(Rubella Virus,RV)多表位诊断抗原,并初步评价其抗原性.将RV衣壳蛋白C aa 3～29、aa 96～123以及包膜糖蛋白E1 aa208～247三个主要免疫显性表位串联,密码子优化后全基因合成;利用基因重组技术将多表位串联片段插入带有GST标签的表达质粒中,在大肠杆菌中进行表达,并利用亲和层析和离子交换层析纯化目的蛋白;利用Western Blot(WB)技术对目的蛋白抗原性进行鉴定,并建立RV-IgM抗体检测ELISA技术,初步评价此方法对阴阳血清样本的鉴别能力.获取高度均质的RV多表位诊断抗原,WB实验表明目的蛋白不但可以被anti-GST单克隆抗体识别,还可以被anti-RV多克隆抗体、RV-IgM阳性血清相应抗体所识别.分别对48份RV急性感染病例的阳性血清、阴性血清和健康人血清进行检测,发现一致性优异.原核表达与层析纯化可以获取抗原性良好的RV多表位诊断抗原,偶联HRP后可以作为检测抗原应用于RV-IgMELISA血清学检测中.
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2001～2011年上海市风疹病毒分子流行病学研究
本研究对2001～2011年本实验室保存的血清标本检测结果为麻疹IgM阴性,风疹IgM阳性病例相对应的咽拭子标本进行风疹病毒(Rubella virus,RV)分离,用RT-PCR方法对细胞培养产物鉴定后扩增病毒El基因,扩增产物用于核苷酸序列测定,并进行分子流行病学分析.结果表明,60份咽拭子标本共分离到31株RV,获得27株RV的739nt(nt8731～nt9469)核苷酸序列,系统同源性分析表明,27株RV分离株分别属于两个不同的基因型,除分离自2011年的11009株、11052株和11106株为2B基因型外,其他分离株均为1E基因型.27株RV分离株大部分的核苷酸突变为无义突变,氨基酸序列高度保守.24株1E基因型分离株中大部分毒株氨基酸序列完全一致,自2001年以来可能有来自同一传播链的RV在持续传播.本研究首次监测到2B基因型RV2011年开始在上海流行,经GenBank核苷酸序列比对发现,其与越南、日本、阿根廷等国家近几年的RV分离株核苷酸序列同源性达99％.由于以前对风疹的监测较少,尚不能证明其来源.
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中国大陆流行的风疹病毒的变异变迁规律研究
从分子水平上探讨1999～2015年中国大陆流行的风疹病毒动态变异变迁规律.方法依据全国麻疹/风疹实验室网络的风疹病毒学监测数据,对1999～2015年中国流行风疹病毒进行分子进化分析.1999～2015年从全国29个省市(除新疆和西藏外)共获得风疹病毒株1737株,分属于4个基因型(1E,1F,2A和2B基因型):①1E基因型风疹病毒自2001年首次分离到之后,替代1F基因型风疹病毒成为2001～2013年中国流行风疹病毒的优势基因型,并从年代上可分为两个进化分支[Cluster A(2004-2015)和Cluster B(2001-2009)],然而自2011年其检出比例逐渐下降,至2015年该比例仅为1.3％;②1F基因型风疹病毒在地理上局限于中国,而在2002年之后未再监测到,推测其在中国的传播可能已被阻断;③2A基因型风疹病毒株均来自于疫苗相关病例;④2000～2015年间中国至少有4个不同的2B基因型风疹病毒传播链(Lineage1-4),2B基因型风疹病毒在2010年之前只有零星的流行,一直处于弱势,但自2011年输入型2B基因型风疹病毒(Lineage 3)的检出构成比逐年增高,并在2014～2015年成为中国流行风疹病毒的主要基因型.通过对中国连续16年风疹病毒变异变迁规律的研究,系统地掌握了其进化和流行规律,同时也为中国风疹控制和将来消除提供了重要的病毒学监测数据.
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风疹病毒包膜糖蛋白E1中二硫键对其细胞融合活性的影响
为了探讨风疹病毒包膜糖蛋白E1中二硫键对风疹病毒细胞融合活性的影响,在构建重组载体pBSK-SPE2E1的基础上,利用PCR定点突变与体内同源重组相结合的方法,构建了11个突变体,分别将E1外功能区的11个半胱氨酸残基突变为其它氨基酸残基,从而去除一个二硫键,利用Giemsa染色法定性检测由此引起的细胞融合情况,流式细胞术检测导入的外源DNA在细胞表面的表达效率,血吸附检测重组表达的突变体蛋白的受体识别活性.结果表明E1外功能区的10个二硫键对RV的细胞融合活性都有重要影响,任何一个二硫键的去除均导致E1的细胞融合活性丧失;其中第5和第8个半胱氨酸残基所形成的二硫键与E2和E1的相互作用有关,第3、第4和第13个半胱氨酸残基所形成的二硫键可能直接影响E1的细胞融合功能.
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含内质控多重荧光RT-PCR同时检测麻疹病毒和风疹病毒的研究
由于从临床症状上难以区分麻疹病毒或风疹病毒引起的人群急性发热出疹性传染病,故而分别设计针对麻疹病毒和风疹病毒的特异性引物和荧光标记探针,建立含内质控的多重荧光RT-PCR以同时检测麻疹病毒和风疹病毒的核酸.结果表明:建立的多重荧光RT-PCR方法特异性好,试验验证没有出现假阳性和假阴性现象;该方法的灵敏度高,对麻疹病毒和风疹病毒的低检出限分别达到0.1TCID_(50)/mL,和1TCID_(50)/mL,可从疑似患者咽拭子等标本中直接检测到病毒核酸;同时该方法具有良好的稳定性,当分别用0.1～10~3 TCID_(50)/mL麻疹和风疹病毒的样本进行重复试验时,其CT值变异系数均在0.9%以下.此外,以人核糖核酸酶P(RNase P)作为内质控,可以有效监控临床标本的采样质量及因操作失误等所致的假阴性结果出现.本方法尤其适用于疑似麻疹或风疹暴发疫情的临床快速诊断.
关键词： 麻疹病毒 风疹病毒 RNase P 多重荧光RT-PCR 内质控 -
辽宁省2007～2012年流行风疹病毒基因特征分析
为了解辽宁省2007～2012年流行性风疹病毒基因特征,本研究用Vero/Slam细胞从辽宁省2007～2012年风疹暴发和散发患者的咽拭子标本中分离到145株风疹病毒(Rubella,RV),应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增RV分离株E1基因的945个核苷酸片段,对扩增产物进行序列测定和分析.将辽宁省145株RV与世界卫生组织(WHO)RV 13个基因型的32株参考株基于739个核苷酸片段的基因定型序列构建基因亲缘性关系树.结果提示,辽宁省2007～2012年145株RV分离株均属于1E基因型,核苷酸和氨基酸同源性为97.2％～100.0％和97.6％～100.0％.与2株WHO 1E基因型参考株(Rvi/Dezhou.CHN/02,RVi/ MYS/01)序列相比,核苷酸和氨基酸同源性分别为96.6％～99.2％和98.2％～100.0％.除RVi/Shenyang.Liaoning.CHN/13.11/13株病毒在E1基因的第246位发生了突变(Val246-Ala246);RVi/Shenyang.Liaoning.CHN/13.11/4和RVi/Liaoyang.Liaoning.CHN/26.11/2株病毒在E1基因的第262发生相同突变(Asp262-Asn262)外,其他毒株在N-型糖基化位、血凝抑制位点和中和位点等重要抗原位点均未发生变化,抗原性稳定.辽宁省所有1E基因型风疹病毒在E1蛋白的第338位氨基酸发生相同突变(Leu338-Phe338).本研究证实1E基因型为辽宁省RV的优势基因型,近6年来辽宁省风疹疫情是由1E基因型RV的多个传播链引起.
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风疹病毒诱导细胞凋亡分子机制的研究进展
风疹病毒是披膜病毒科风疹病毒属的唯一成员,能够诱导细胞发生细胞凋亡.Ras-Raf-MEK-ERK和PI3K-Akt信号通路是病毒增殖与细胞生存的必要通路,在细胞凋亡过程中起着必不可少的作用.p53蛋白和TAp63蛋白能够进入细胞核与DNA特异结合,抑制Bcl-2的表达,促进Bax的表达,导致线粒体内外膜间的物质(细胞色素C等)释放,进而引起caspase级联反应,终导致细胞凋亡.本文从风疹病毒感染的细胞系,病毒感染导致的细胞病理改变和病毒诱导的细胞凋亡信号通路及其相关因子等方面对风疹病毒诱导细胞凋亡的分子机制进行了综述.
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风疹病毒JR23株包膜糖蛋白E2的遗传与变异分析
为了探讨风疹病毒(rubella virus,RV)包膜糖蛋白E2的基因与蛋白的遗传与变异特点,利用DNAstar软件比较JR23株与GenBank中各参考株E2的基因与多肽序列,分析不同RV株E2基因之间的同源性及E2蛋白功能关键区的氨基酸变异.结果表明,RV E2基因序列比较保守,但JR23株E2基因序列与其它9个分离株之间有明显差异,变异主要集中在484nt～554nt.同源性为90.3％～92.6％之间,与美国疫苗株RA27／3同源性高,与美国疫苗株HPV77同源性低,GenBank中的参考株间同源性较高,在96.3％～100.0％之间.E2多肽变异集中于161aa～185aa,但在E2功能关键区,如N端序列、N联糖基化位点、胞质区等则无明显变异.表明RV E2基因序列相对保守,虽然JR23株与GenBank中各参考株的E2基因序列有明显差异,但JR23株E2蛋白在功能关键区表现出遗传稳定性.此结果为阐明RV分子流行病学特征提供了理论依据,也为研究RV分子进化特征及病毒与宿主细胞的相互作用奠定了坚实基础.
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应用实时定量PCR技术研究人重组干扰素α2b在人群中对麻疹病毒和风疹病毒的抑制作用
麻疹病毒(measles virus)是一种导致麻疹的副粘病毒科麻疹病毒属的单股负链RNA病毒.麻疹是儿童常见的一种急性呼吸道传染病.临床上以发热、上呼吸道炎症、结膜炎、口腔粘膜斑及全身丘疹为特征[1].风疹病毒(rubella virus,RUV)属于披膜病毒科风疹病毒属.孕妇特别是怀孕3个月以内的孕妇感染风疹病毒后,可以引起胎儿畸形.麻疹病毒和风疹病毒的实验室检测包括病毒分离、病毒特异性IgM的检测、分子杂交直接检测病毒RNA、RT-PCR、RT-nested PCR(RT-nPCR)等[2-3].
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风疹病毒JR23株E1包膜糖蛋白基因的表达分析
风疹病毒(rubella virus,RV)是披膜病毒科风疹病毒属的唯一成员.通常RV感染症状较轻,表现为急性、轻型、病程短、自限性出疹性疾病.RV对公众健康的大威胁是它的致畸特性.妇女妊娠期,尤其是前3个月感染RV可导致新生儿产生一系列的器官畸形,称为先天性风疹综合征(CRS)[1].
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风疹病毒包膜糖蛋白分子生物学研究进展
风疹病毒(rubella virus,RV)是披膜病毒科风疹病毒属的唯一成员,是常见、重要的TORCH综合征病原体之一.其感染的危害主要在于先天性感染,孕妇在妊娠期、特别是妊娠前3个月感染RV,可引起胎儿宫内感染,产生先天性风疹综合征(congenital rubella syndrome,CRS),造成婴儿全身多种器官发育畸形或功能异常,如白内障、耳聋、先天性心脏病等,严重时可出现死胎或流产.
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育龄妇女风疹病毒抗体检测结果分析
目的 通过对育龄妇女血清风疹病毒(RUV)IgG和IgM浓度的检测,了解育龄妇女对RUV的免疫力和近期感染状况,从而指导优生优育.方法 采用酶联免疫吸附试验( ELISA)方法检测7077例育龄妇女血清RUV-lgG和RUV-lgM浓度,并按照不同年龄进行分组和数据分析.结果 RUJV-lgG总阳性率为80.94％,四个年龄组阳性率比较,差异有统计学意义(P＜0.05),阳性率随着年龄的增加而降低；RUV- lgM总阳性率为1.03％,四个年龄组阳性率比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 大多数育龄妇女对RUV有免疫力,但仍存在一定的感染,应加强育龄妇女孕前及孕期RUV抗体检测,提高出生人口素质.
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风疹病毒野生株感染ECV304血管内皮样细胞的细胞病变效应
目的通过体外培养和风疹病毒野生株感染ECV304血管内皮样细胞,初步探讨中国大陆流行的风疹病毒野生株的致病变性特征.方法常规方法培养ECV304血管内皮样细胞和病毒接种,RT-PCR和间接免疫荧光法检测风疹病毒包膜糖蛋白E1基因的表达,相差显微镜及电子显微镜下观察细胞受病毒感染后形态变化,脱氧核糖核酸末端转移酶法(TUNEL)检测细胞凋亡.结果感染后2～3 d即可检测到风疹病毒包膜糖蛋白E1基因表达;感染后4 d,相差显微镜观察呈现明显的细胞病变效应,即细胞悬浮脱壁、细胞体变圆缩小、细胞膜皱缩、染色质浓缩等;电镜下观察可见明显病毒颗粒,核染色质浓集、边缘化,线粒体聚集于细胞核周围呈溶酶体化、空泡化和自噬现象.TUNEL法检测细胞凋亡指数(AI)在病毒感染组与对照组间有显著性差异(P＜0.01).结论风疹病毒野生株在ECV304细胞中有明显的致细胞病变效应,在体外细胞培养下可诱导ECV304血管内皮样细胞凋亡.
