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微载体技术高密度培养MRC-5细胞初探
目的 通过探索MRC-5细胞的微载体培养条件,以期建立MRC-5细胞的高密度培养方法.方法 用3种不同培养基(MEM、M199、DMEM)分别培养3.0×104/mL的MRC-5细胞,观察它们的细胞增殖及传代能力；在Spinner培养系统中,用1.0 g/L Cytopore 2和3.0 g/L Cytodex 3分别培养密度为3.70× 105/mL和2.98×105/mL的MRC-5细胞,观察两种载体对细胞生长代谢和细胞密度的影响,筛选出适宜的培养基及微载体.使用5 L CelliGen310生物反应器对筛选获得的培养基及微载体进行MRC-5细胞的灌流培养初步摸索.结果 MRC-5细胞在MEM、M199、DMEM培养基中培养96 h细胞分别增殖了7.0、4.4和3.0倍；在MEM培养基中连续传代至5次以上,细胞增殖稳定,1:3传代72 h形成致密单层,而在M199和DMEM培养基中连续传代均未能获得理想的细胞形态.经96～120 h的培养后,使用1.0 g/L Cytopore 2培养的MRC-5细胞密度达到2.20× 106/mL高于使用3.0 g/L Cytodex 3的1.12×106/mL,且前者葡萄糖和乳酸代谢较后者更为活跃.首选MEM和Cytopore 2作为MRC-5细胞的灌流培养体系.在5L生物反应器中以1.0 g/L Cytopore 2和2.5LMEM培养基培养MRC-5细胞至144h,细胞密度达到1.54×106/mL.结论 初步建立的MEM Cytopore 2微载体细胞培养方法能够获得高密度、活性良好的MRC-5传代细胞.
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动物细胞培养技术的进展
组织培养技术是19世纪末由胚胎学技术衍生而来.近一个世纪,从能维持组织存活到生长出新细胞,从少数组织到各种组织细胞的培养,从精细的实验室培养技术到大规模的生产工艺 ,组织培养技术已成为生物制品制备以及基因工程等领域必不可少的工具之一.随着生物制品需求的不断增加,动物细胞的培养技术已向着大型化、自动化、精细化的方向发展.本文就近年来动物细胞培养技术有关的微载体、氧供应及无血清培养等问题作一文献回顾.微载体
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MRC-5人二倍体细胞培养条件的优化
目的：对 MRC －5人二倍体细胞培养条件的优化比较。方法用3种不同的培养基将 MRC －5人二倍体细胞在 T25方瓶和 Spinner 培养系统 Cytodex1微载体2种培养体系进行培养比较，每天观察细胞形态，进行细胞计数，绘制生长曲线，并检测葡萄糖－乳酸值，筛选出1种较适宜培养基，用不同级别的牛血清比较其生长增殖情况。结果3种培养基在细胞形态，细胞的贴壁、分裂以及维持等方面无明显差异。但在增殖上，在2种培养体系中 MEM （43．25±0．60）×104 cells／mL，（12．98±1．27）×105 cells ／mL 与 M199（35．40±1．41）×104 cells／mL，（10．76±1．31）×105 cells ／mL 及 DMEM／F12（36．75±1．59）×104 cells／mL，（11．22±1．42）×105 cells ／mL 比较，差异均有统计学意义（P ＜0．01），MEM培养液细胞增殖5．17和6．49倍，优于 M199和 DMEM／F12培养液。进口胎牛血清细胞增殖（4．55±0．51）×105 cells ／mL，优于其他 3种牛血清的（4．12±1．03）× 105 cells ／mL、（3．59±0．48）×105 cells ／mL 和（3．53±0．52）×105 cells ／mL。结论3种培养基都可以用于MRC －5人二倍体细胞的繁殖培养，但 MEM培养液更佳。进口胎牛血清较其他血清有优势。
关键词： MRC-5 人二倍体细胞 细胞生长周期 牛血清 微载体 -
微载体规模化培养MDCK细胞增殖H9N2亚型禽流感病毒的研究
目的 探索H9N2亚型禽流感病毒株(A/Chiken/NX/9/99)在微载体大规模培养的MDCK细胞中的增殖规律,确定佳增殖条件.方法 将H9N2亚型禽流感病毒株接种到生长在24孔培养板上的MDCK细胞中进行增殖试验,检测接种不同感染剂量病毒、添加不同浓度TPCK-胰酶、在不同pH值的培养液中培养,接毒后不同时间的病毒血凝素滴度(HA).根据佳增殖条件将病毒接种至生长在微载体上的MDCK细胞中,利用250mL和5L转瓶逐级进行大规模增殖.结果 佳病毒增殖条件为TPCK-胰酶终浓度为10 μg/mL,接毒剂量为MOI=0.025,培养液pH值为7.4,在此条件下,H9N2亚型禽流感病毒株(A/Chiken/NX/9/99)适应在250mL和5L转瓶中微载体培养的MDCK 细胞内大量增殖,病毒的高血凝价均可达到9log_2(1:512).结论 本研究为以哺乳动物细胞为基质规模化生产禽流感疫苗奠定了基础.
关键词： 微载体 H9N2亚型禽流感病毒 MDCK细胞 规模化培养 -
应用微载体Cytodex 3高密度培养L-02人肝细胞系
目的探讨用微载体进行L-02人肝细胞系高密度培养的方法,以期为生物人工肝提供有应用价值的生物材料.方法在限制贴壁的条件下,采用Cytodex 3为材料进行L-02人肝细胞的微载体培养,诱导肝细胞聚集体的形成,定期进行细胞计数及培养上清白蛋白、尿素、谷草转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)等生化指标的检测,并在光镜和透射电镜下观察生长情况.结果培养至第6天时,所有的微载体均包满细胞,并形成微载体诱导的肝细胞聚集体,细胞数量达高峰为(17.1±0.76)×107/瓶,同时白蛋白和尿素的合成亦高,浓度分别为53.81±1.64 mg/L和5.35±0.13 mmol/L.结论Cytodex 3培养的L-02人肝细胞可形成高密度的肝细胞聚集体,具有一定的生物合成和代谢功能.
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体外组织构建技术的研究进展
构建具有生物活性的组织或器官一直是组织工程和再生医学研究的重点领域.为了促进组织工程产品的规模化、产业化,体外组织工程近年来获得了发展.本文将从体外组织构建出发,对体外组织构建的相关技术,包括传统的多孔支架构建、无支架构建(微载体和微囊化)以及水凝胶细胞复合体构建等构建模式进行综述.
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人脂肪干细胞结合微载体在生物反应器中向软骨细胞分化
[目的] 探索在旋转生物反应器内,应用微载体技术快速扩增并向软骨分化人脂肪干细胞.[方法] 将人脂肪干细胞结合Cytodex3微载体在旋转的生物反应器(RCSS)内进行动态培养,应用倒置显微镜和扫描电镜对微载体表面的脂肪干细胞进行动态观察,并对收获的脂肪干细胞进行Safranin-O、toluidine blue染色等组织化学染色及Ⅱ型胶原的免疫化学染色分析.[结果] 脂肪干细胞于24 h内贴附于Cytodex3微载体表面,细胞形态为短梭形,随时间的延长,贴附于微载体的细胞逐渐增多,到培养后期,细胞密度可达初接种的19倍左右,在微载体上收获的细胞进行番红花O、阿利新蓝染色呈阳性,Ⅱ型胶原染色阳性,均强于对照组.[结论] 利用微载体细胞培养技术可简便快速地在体外扩增脂肪干细胞,并成功实现向软骨细胞分化.
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羊软骨细胞在生物反应器中的培养和扩增
[目的]探索在旋转生物反应器内,应用微载体技术快速扩增分化良好的羊软骨细胞的方法.[方法]将培养的羊软骨细胞应用Cytodex-3微载体在旋转生物反应器(RCSS)内,进行动态培养,应用倒置显微镜对微载体表面的软骨细胞进行动态观察,并对收获的软骨细胞进行Ⅰ、Ⅱ型胶原的细胞免疫化学染色分析.[结果]关节软骨细胞于1 d内贴附于Cytodex-3微载体表面,细胞初期为圆球形、半球形凸起,逐渐向周围伸展,随时间的延长,贴附于微载体的细胞逐渐增多,到培养后期,细胞密度可达初接种的15～17倍,在微载体上收获的软骨细胞经Ⅰ型胶原的免疫细胞化学染色呈阴性,Ⅱ型胶原染色则呈强阳性.[结论]利用微载体细胞培养技术可简便快速地在体外扩增羊软骨细胞,可为构建组织工程化人工软骨提供大量活性、分化良好的软骨细胞.
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微载体技术体外扩增人骨髓间充质干细胞
目的:建立一种快速、大量扩增人骨髓间充质干细胞(hMSCs)的方法,以满足组织工程技术治疗大段骨缺损对细胞数量的需要.方法:普通培养的第3代人MSCs1×107个及0.5gCytodex3微载体,加入有100ml培养基的搅拌生物反应器中培养,在前6h,每隔半小时以40r/min的速度搅拌2min,以后连续搅拌.于培养的第1、3、5、7、9、11d取样在相差显微镜下动态观察细胞生长情况,后进行细胞表面生长因子的检测.结果:接种24h后87%的MSCs细胞贴附于微载体并铺展,3d后生长加速,约8～9d后细胞生长达大值.终细胞收获密度为接种时的约15～20倍.流式细胞仪检测显示,所培养的MSCs均一的表达CD29和CD44,而CD34、CD45和HLA-DR阴性.结论:应用微载体技术可以大量、快速的培养扩增人骨髓间充质干细胞,细胞表面抗原特性不变,能够满足组织工程技术治疗大段骨缺损的需要.
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微载体复合间充质干细胞构建3D细胞球对体外周围神经再生的影响
[目的]探索微载体复合间充质干细胞构建三维(three-dimension,3D)细胞球对周围神经再生的体外实验研究.[方法]选取48 h SD乳鼠,腹股沟处取脂肪组织,经消化、过滤、离心、分离培养得到脂肪间充质干细胞,然后将脂肪间充质干细胞与微载体构建3D细胞球,将构建好的3D细胞球与背根神经节共培养,根据添加不同培养方式的细胞球而分成3组,具体分组如下:单纯背根神经节培养组,2D细胞与背根神经节共培养组,3D细胞球与背根神经节共培养组.[结果]单纯背根神经节培养组轴突生长长度(341.66 ±9.01) μm,2D细胞与背根神经节共培养组轴突生长长度(395.33±24.9) μm,3D细胞球与背根神经节共培养组轴突生长长度(487.00 ±5.00)μm.3D细胞球组对背根神经节轴突生长的促进作用较2D共培养组更明显,差异有统计学意义(P＜0.05).[结论]基于微载体的3D细胞球对背根神经节轴突生长作用更明显,为以后神经组织工程治疗神经缺损提供良好的种子细胞,从而提高神经再生的能力.
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微载体/水凝胶复合支架修复大鼠膝关节骨软骨缺损
[目的]探索以负载软骨细胞的Cytodex-3微载体和藻酸钠水凝胶为材料,制备微载体/水凝胶复合支架,并观察以此修复大鼠膝关节骨软骨缺损的效果.[方法]将大鼠软骨细胞与Cytodex-3微载体置于旋转式三维生物反应器(rotary cell culture systems,RCCS)中,软骨细胞在微载体表面快速大量扩增后,将负载有软骨细胞的微载体均匀的与藻酸钠水凝胶混合,制备微载体/水凝胶复合支架,并以此修复大鼠股骨滑车骨软骨缺损.实验分3组,A组:负载有软骨细胞的Cytodex-3微载体/藻酸钠水凝胶复合支架修复组;B组:单纯Cytodex-3微载体/藻酸钠水凝胶复合支架修复组;C组:空白对照组.术后6、12周取材,据大体、组织学、Micro-CT等检测结果对骨软骨修复效果进行评估.[结果]大体观显示A组的软骨修复效果明显优于B组和C组.组织学分析示A组的修复组织主要以透明软骨为主,而B组和C组主要以纤维组织为主.Micro-CT扫描结果表明各种软骨下骨均得到不同程度的重建,A组效果优于其他两组,比较差异有统计学意义.[结论]负载软骨细胞的微载体/藻酸钠水凝胶复合支架能够高效的修复大鼠股骨滑车骨软骨缺损,这种将微载体与水凝胶结合构建复合支架的方法,为组织工程软骨的制备提供了新的途径.
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微载体旋转立体培养成人退变髓核细胞增殖及生长动力学研究
[目的]通过单层培养和微载体旋转立体培养成人退变髓核细胞对比,研究两种培养方式对其生长活性及增殖能力的影响.[方法]本实验通过Trypan blue法计数细胞并绘制生长曲线,应用3H- TdR放射免疫法检测退变髓核细胞增殖活性,流式细胞仪检测退变髓核细胞周期,比较两种培养方式对细胞增殖的影响.[结果]微载体旋转立体旋转培养较单层培养细胞从贴壁到对数生长期开始时间( 16～20 d)较长,但是严格意义的稳定生长期(3～5 d)很短；对数生长期长,一般14 ～ 17 d,期间细胞增殖活跃.两种培养方式的细胞处于稳定生长期时,细胞增殖能力没有明显区别,而处于对数生长期时,微载体培养的细胞的增殖能力明显高于单层培养组的细胞(P＜0.05).细胞周期测定显示两种细胞停滞在G0/G1期的占71％左右,培养方式对其影响不明显.而微载体培养的细胞的S期明显较单层培养的细胞为长(P＜0.05).[结论]成人退变髓核应用微载体培养后增殖能力及生长活性提高,可解决组织工程学椎间盘种子细胞难以收集的难题,为将来开展椎间盘组织工程学的研究奠定良好的基础.
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可注射性组织工程软骨源性微载体的微观结构及其生物相容性观察
[目的]改进软骨源性微载体的制备方法.对其微观结构特征及其与骨髓间充质细胞的生物相容性进行观察,探索新的可注射性组织工程软骨的制备方法.[方法]将新鲜的猪关节软骨在液体中粉碎,梯度离心后制备成150～300 μm的颗粒,去细胞处理后采用常规组织学方法观察软骨微粒的空间结构及化学组成,采用扫描电镜观察软骨源性微载体的形态特征,随后体外获取扩增骨髓间充质细胞,与软骨微粒复合,然后采用旋转式生物反应器扩增,构建可注射性组织工程软骨细胞.[结果]本研究制备的软骨微粒呈圆形或椭圆形,表面呈毛刷状结构,主要成分是Ⅱ型胶原和GAG,而毛刷的主要成份Ⅱ型胶原、骨髓间充质干细胞不仅与微载体结合良好,还能够在其表面大量扩增.[结论]与传统的微载体不同,软骨源性微载体与细胞复合后,不需要再将细胞消化,避免了软骨细胞外基质的损失,可以作为可注射性组织工程软骨的理想材料和方法.
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微载体旋转立体培养对成人退变髓核细胞凋亡调控的研究
目的 采用微载体旋转立体培养法对成人退变髓核细胞进行扩增,研究细胞凋亡情况,探讨髓核细胞凋亡在椎间盘退变中的作用.方法 手术切除的退变髓核组织行原代培养,传代后随机进行单层培养和微载体旋转立体培养,采用Annexin-V-PI染色,流式细胞仪定量检测早期细胞凋亡,应用免疫组化方法检测凋亡抑制因子Bcl-2的表达,DeadEndTM比色法检测细胞晚期凋亡情况.结果 流式细胞仪定量检测可见细胞在稳定生长期时,微载体旋转立体培养法较单层培养法髓核细胞的凋亡率低(P＜0.05),在对数生长期两种培养方法无明显差别(P＞0.05).Bcl-2指标及DeathEndTM比色法检测显示在两个时期内,微载体旋转立体培养法培养的细胞凋亡率较低(P＜0.05).结论 微载体旋转立体培养法可较好地降低髓核细胞凋亡率,是一种较有前途的髓核细胞培养方法,为组织工程化椎间盘髓核种子细胞的研究奠定了基础.
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明胶、丝素-壳聚糖微载体培养肝细胞的比较研究
目的 自制丝素-壳聚糖多孔微载体,在模拟微重力条件下接种培养肝细胞,并与多孔微载体Cultispher S上的细胞生长状况进行比较.方法 油包水乳化后以冻干法制作丝素-壳聚糖多孔微载体.培养体积50 ml,以旋转培养系统分别对接种至丝素-壳聚糖多孔微载体和Cultispher S的CL-1细胞进行培养,并动态观察形态学、细胞计数,检测人源性白蛋白分泌和尿素合成功能.结果 CL-1细胞在Cultispher S上呈单层生长,在丝素-壳聚糖多孔微载体上呈现多层生长.第9天细胞计数结果达到峰值,丝素-壳聚糖多孔微载体的细胞密度可达到5.7×106个/ml,明显高于Cultispher S组(P<0.01).自培养第10天起,丝素-壳聚糖多孔微载体组上清中的人源性白蛋白和尿素水平均明显高于Cultispher S组(P<0.01).结论 相对Cultispher S,丝素-壳聚糖多孔微载体更适合在微重力条件下培养CL-1细胞.
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在线微载体肝细胞荧光示踪研究
目的 拟探讨SYTO/EB在微载体细胞培养中活体细胞原位示踪的应用价值.方法 采用活细胞核酸染色剂(SYTO13)和溴化乙啶(EB)2种核酸染色剂对微载体生长的细胞进行双重染色,荧光显微镜下通过颜色不同判断细胞的活力状态并计算出活力百分比.以间接活力测定的四氮唑盐法同时对肝细胞进行活力的检测,并将结果进行比较.结果 2种方法测定的结果均可显示微载体生长的肝细胞.但SYTO/EB法更灵敏,可精确计数.结论 SYTO/EB测定微载体肝细胞的活力快速、灵敏且简便,并可原位观察细胞的活力,不失为一种可取的微载体活力检测方法.
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旋转生物反应器内微载体大规模扩增肝细胞
目的 评估旋转生物反应器(RCCS)内肝细胞微载体大规模培养的可行性.方法 为获取足够数量活性良好的肝细胞种子细胞.本实验探索在RCCS内应用微载体技术快速扩增肝细胞的方法 .将cL-1细胞和HepFMMU应用Cytodex-3微载体在RCCS内进行动态培养,观测肝细胞的生长情况和细胞代谢率.结果肝细胞在Cytodex-3微载体上生长迅速、生长倍增时间缩短,并保持很高的生物活性.培养至第5天,细胞数量可达初接种的23倍.细胞的数量在第5天左右达到高,然后开始下降.功能学检查、倒置显微镜、扫描电镜及MTT均提示细胞功能良好.结论 RCCS微载体肝细胞大规模培养是一种可行的细胞快速扩增方法 ,但对于人工肝庞大的细胞数量和功能需求,应进一步研究,通过优化营养和废物排除,模拟肝脏生理结构,提高细胞培养规模和功能.
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大鼠肝细胞的微载体黏附培养及其功能测定
目的 探讨一种简单获取大量高活性肝细胞的培养方法.方法 用半原位酶消化技术对SD大鼠肝细胞进行分离与微载体黏附培养,连续观察肝细胞的形态.检测肝细胞的白蛋白分泌功能和葡萄糖合成功能,并同时与贴壁培养的肝细胞比较.结果 黏附培养的肝细胞存活率、白蛋白分泌功能、葡萄糖合成功能都保持较高水平,优于贴壁培养的肝细胞.结论 微载体培养能提供长时间保持高活性、高密度生长的肝细胞,为肝细胞移植,肝病防治以及生物人工肝等领域的研究和广泛应用提供了基础.
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混合型生物人工肝的体外功能
目的 设计一种新型混合型生物人工肝(HBAL)并通过对模拟肝衰竭血清的净化作用评价其疗效,探讨其临床应用的可行性.方法 选用中国人肝细胞株-1(CL-1)作为肝细胞供体,在微重力环境下,肝细胞微载体共培养方法培养至第5天,细胞总量约4.0×109个,细胞密度约为4.0×1010/L,在无菌环境下灌人自制生物反应器中,制成生物部分,非生物部分采用血液灌流+胆红素吸附,生物部分和非生物部分通过两套聚乙烯胶管构成一个封闭的环路,监测模拟肝衰竭血清中未结合胆红素、鹅去氧胆酸,胆酸、血氨经过HBAL循环后浓度的变化以及生物反应器中肝细胞功能、形态及肝细胞活性的变化.结果 整个治疗过程中循环前24h内,模拟肝衰竭血清中未结合胆红素(UBD)、鹅去氧胆酸(CDCD),胆酸(CA)和血氨(AA)的浓度分别从(335.3±6.0)、(395.0±5.6)、(155.7±4.5)、(39.0±2.6)μmol/L下降至(106.0±10.9)、(131.8±28.7)、(42.2±7.3)、(3.5±1.0)μmol/L,与0h比较差异有统计学意义(P=0.041),24h后浓度下降趋于平稳;循环48h后,CL-1细胞功能发生变化,生物反应器中模拟肝衰竭血清中的谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)分别从(25.9±4.2)IU/L、(22.0±3.6) IU/L、(0.28±0.09) μmol/L升高至(31.0±2.6) IU/L、(31.6±8.0)IU/L、(0.41 ±0.12) μ.mol/L,与0h比较差异有统计学意义(P=0.027);并且整个反应器中肝细胞的数量和活力在循环48 h后也呈现显著性下降(P=0.044).结论 (1)构建了一种新型灌流型生物反应器,该生物反应器中的CL-1细胞能够保持较高的活性和良好的功能.(2)新型混合生物型人肝可以显著降低模拟肝衰竭血清中的未结合胆红素、鹅去氧胆酸,胆酸、血氨的浓度,具有清除这些毒性物质的功能,提示其具有明显的肝功能支持作用.
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体外培养组织工程用人骨髓间充质干细胞的试验性研究
目的 本研究对人骨髓问充质干细胞(hBMMSCs)进行基本生物学特性研究,并探讨以微载体培养技术进行大量增殖的可能性.方法 对成人骨髓血用Percoll淋巴细胞分离液进行密度梯度离心,以获取hB-MMSCs.原代和传代培养后描绘细胞增长曲线.以流式细胞术对所获取的hBMMSCs进行细胞表型鉴定.以Cytodex3微载体对hBMMSCs进行动态培养,并与无微载体培养的细胞进行数量对比.结果 以Percoll淋巴细胞分离液可成功地对人骨髓血进行间充质干细胞的分离,原代和传代培养后细胞生长良好.以流式细胞术对hBMMSCs进行表型鉴定,其中CD29、CD44、CD73、CDl05和CD147呈阳性表达,阳性率高于96%;CD71、CD90的阳性率为86.74%和71.01%;而CD14、CD34、CD38、CD45和HLA-DR呈阴性表达,且大多低于2%.以Cytodex3微栽体进行动态培养时,hBMMSCs能够在微栽体上迅速贴附、铺展并生长.在相同的时间点,当hBMMSCs在微载体表面长满时,细胞数目均显著多于无微栽体的培养方法 (P＜0.001),其细胞密度和培养速度至少是普通培养法的4.5～9.6倍.Cytodex3上细胞数目的 大量增长大约在第8天后进入平台期.结论 应用PercoH淋巴细胞分离液能便捷地将hBMMSCs从人骨髓血中分离提取出来,对细胞活性影响小,并可以流式细胞术快速有效地鉴定其表面标记物.已获取的hBMMSCs的纯度较高,而且表型也较均一.与普通培养相比较,Cytodex3微载体培养体系可以在相同时间内获取大量的hBMMSCs,便于进一步开展在心血管外科领域的组织工程学应用.
