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心肌细胞分离术
心肌细胞分离方法在不断得到改进.根据实验目的的不同,不断调整分离程序及方法[1～3].但要得到高产量,有持久(＞2 h)兴奋性和收缩功能的心肌细胞,仍不是一件容易的事[3],尤其是我们在整体或离体心脏复制各种疾病模型(缺血,心肌肥大等),要在单心肌细胞功能方面研究其病理生理机制时.胶原酶消化分离出的心肌细胞在产量及活力方面受胶原酶, 缓冲液成分,pH,温度,灌流量及消化时间的影响[3,4].
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TERT-原位杂交技术的使用难点及解决方法
RNA原位杂交技术在基因分析和诊断方面能作定性、定位和定量分析,已成为有效的分子病理学技术之一[1].用寡核苷酸探针检测组织切片中相关的mRNA是较为常见的RNA原位杂交[1],而Telomerase Reverse Transcriptase(TERT)又是较为常用的原位杂交检测试剂盒,其探针较短,组织穿透性好,有较高的灵敏度.由于在大多数的恶性肿瘤中存在着TERT-RNA,所以,TERT-原位杂交检测方法可以应用于众多的恶性肿瘤的诊断.但由于该方法存着消化时间、杂交时间、温度难以掌握以及杂交液滴加多少较难控制等技术难点,常常会使结果出现假阳性或假阴性.我们采用TERT-原位杂交检测方法对舌癌标本进行了检测,经过反复的实践、改进,解决了许多的难点,获得了比较满意的结果,现报道如下.
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人成纤维样滑膜细胞原代培养的改良方法
目的 探讨人成纤维样滑膜细胞原代培养的改良方法 .方法将骨关节炎患者的滑膜组织机械分离后用Ⅱ型胶原酶分别消化0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h.离心去上清,将细胞及未消化完全的组织块混合物转入培养瓶培养.待细胞贴壁后分别计数不同消化时间的贴壁细胞数,待细胞生长良好后,进行免疫荧光鉴定.结果 细胞生长状态良好,不同消化时间下培养24 h后均可观察到大量细胞贴壁且呈梭形,并可见成纤维样滑膜细胞从组织块下方爬出.经胶原酶消化12 h后的贴壁细胞数多(P<0.05).免疫细胞化学染色显示培养的细胞波形蛋白和CD90/Thy-1阳性.结论 单独的Ⅱ型胶原酶消化法可以获得成纤维样滑膜细胞,佳消化时间为12 h.
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流式细胞术PI染色法检测胃蛋白酶消化时间对细胞凋亡的影响
目的 探讨凋亡样品制备时,胃蛋白酶消化时间对凋亡的影响.方法 采用0.5%胃蛋白酶分别对胃癌、食管癌、乳腺癌、淋巴瘤和卵巢癌细胞株进行消化,观察不同时间点流式细胞术PI染色法检测凋亡的情况.结果 多数细胞株消化时间在20～30 min时所形成的凋亡峰位较好,而肝癌、淋巴瘤细胞则在15～20 min时形成的峰位较好.结论 流式细胞术PI染色法检测凋亡时,需不断摸索实验的条件,才能得到佳结果.
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鼠胚脊髓运动神经元原代培养方法的改进
神经细胞原代培养是研究神经细胞形态及功能的重要手段之一.传统方法是将神经细胞与神经胶质细胞混合培养,无法满足在单一神经细胞培养基础上进行实验研究的需要.本实验在传统培养方法的基础上加以改良,对原混合培养方法在胎龄、取材、温度、消化、换液、抑制剂、机械操作等方面进行了控制和改进.本培养方法具体改进如下: 1.运动神经细胞取自E14大鼠胚胎的脊髓.因为胚胎运动神经元形态分化和化学分化程度较低,体外存活能力强,E14胎鼠脊髓易剥离.而传统方法是取E12～E16.E1 2胎鼠组织太嫩,不易分离;E16胎鼠脊柱已部分骨化,血液太多,挑离脊髓时易形成撕裂损伤.2.取材时将脊髓沿冠状面切开,取脊髓腹侧半,改变传统的整个脊髓培养,以达到培养单一运动神经元的目的.3.整个取材过程在冰袋上进行,更好的保持细胞活力.4. 严格控制胰酶的浓度和消化时间.胰酶浓度是0.125%,37℃二氧化碳孵育箱内消化 0.5hr较好,采用4℃含血清的DMEM液适时终止反应.为避免组织丢失,改吸弃胰酶为吸组织于另一试管中,且迅速终止消化反应.5.减少传统方法中的吹打次数,用弯头吸管代替直头吸管吹打;取消离心或细胞筛过目等步骤,降低细胞损害程度.6.细胞种植后改传统换全液为换半液,改传统培养2d换液为定时观察,按需换液.这样不仅保证了细胞在已适应了的环境中生长,并且减少了污染的机率.7.本方法不使用抑制剂,减少药物对运动神经元的损伤,使神经细胞在更接近于体内自然环境中生长.种植细胞1～2hr即可观察到细胞贴壁,胞体呈圆形,饱满、透亮,有短的突起出现.因此,本方法的优点是: 不仅能够大大缩短从取材到种植的时间,提高运动神经元的活性,而且成功的获得了相对单一的运动神经元培养物(纯度达90%以上),为进一步开展神经生物学研究提供了相对稳定的体外模型.
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不同消化时间下胶原酶对人脐带间充质干细胞分离的影响
目的：比较胶原酶的不同消化时间，观察所获得的间充质干细胞的数量，确定为理想的消化时间。方法：分别采用3h、5h、7h的消化时间分离脐带间充质干细胞；通过传代进行纯化和扩增培养，绘制生长曲线；用流式细胞仪检测其表面标志。结果：分离出的间充质干细胞贴壁后为梭形，呈平行排列生长或漩涡状生长，并且消化时间为5h时收获到的细胞数量多；流式细胞仪检测结果显示，获得的间充质干细胞均表达CD73、CD105、HLA－ABC，不表达CD34、CD45、HLA－DR。结论：胶原酶消化法从人脐带中分离培养的细胞具有间充质干细胞的生物学特性，并且消化5h收获得的间充质干细胞数量多，生长状况好。
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健康公告牌
●不可不知饭后别马上吃"消食水果"很多人习惯餐后立刻吃水果,并美其名曰"消食水果".其实,食物进入胃内需经过1～2个小时的消化才能缓慢排出,如果是一顿充满蛋白质和脂肪的大餐,消化时间甚至需要6～7个小时.
